（FDA 2018/05/21 现行定稿指南）
I. 介绍
本指导原则有助于研究用新药申请（IND）或新药申请（NDA）、仿制药申请（ANDA）、生物制品许可（BLA）和补充申请的申请人在需要 药代动力学、毒代动力学或生物标志物浓度评估的人体临床药理学、生物利用度（BA）、生物等效性（BE）研究的生物分析方法验证。2 该指南还可以为需要毒代动力学或生物标志物浓度数据的非临床研究的生物分析方法的开发提供参考。对于兽药批准过程相关的研究，如研究用新动物药申请（INADs），新动物药申请（NADAs）和简化新动物药申请（ANADAs），本指南可适用于血液和尿液 BA、BE 和药代动力学研究。本指南中的信息适用于定量测定生物基质（如全血、血清、血浆、尿、组织例如皮肤）中药物、代谢物、治疗用蛋白、和生物标志物水平的生物分析方法，如色谱分析（CC）和配体结合分析（LBA）。本定稿指南考虑了2013年指南草案收到的公众意见，并为生物样品分析方法的开发、验证和试验中的使用提供建议。根据生物分析方法的具体类型，如果有合理性依据，可以修改本指南的建议。本指南反映了生物分析方法验证方面的进展。通常，FDA指南文件不具有法律执行责任。指南介绍了FDA对于某一话题的当前看法，除非引用了特定的监管或法律要求，指南应仅被视作建议。“should”在FDA的指南文件中意为某事是建议或推荐做法，不是规定。
II. 背景
2001年“生物分析方法验证”行业指南最初是基于两个研讨会的考虑，这两个研讨会的题目是：
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分析方法验证：生物利用度，生物等效性和药代动力学研究3
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以下额外的研讨会，为后续修订提供参考（例如，2013年的指南草案“生物分析方法验证”5):
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定量生物分析方法验证和实施：色谱和配体结合分析的最佳实践2
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美国药学科学家协会 / FDA“用于评价方法重现性的试验样品再分析”的研讨会7
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美国药学科学家协会（AAPS）举办的“定量生物分析方法验证和实施 – 2013年版FDA指南”研讨会8
特定生物基质（如血液，血浆，血清或尿液）中的分析物（即，药物、包括生物制产品及其代谢物）和生物标志物进行定量评估的经过验证的分析方法，对于非临床、生物药剂学、和临床药理学研究的成功实施是至关重要的。这些经过验证的方法提供了关键数据，以支持药品和生物制品的安全性和有效性。分析方法的验证通过解决以下关键问题，可确保数据的可靠性，关键问题包括：
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该方法是否可以检测预期的分析物？例如，是否有物质干扰检测，分析方法是分析物特有的或选择性的方法？
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与检测相关的变异性是多少？例如，该方法的准确度和精密度？
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提供可靠数据的检测范围是多少？例如，该方法的灵敏度是多少（例如，该方法的定量下限（LLOQ）、定量上限（ULOQ）是多少？）
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样品采集、处理和储存如何影响生物分析方法数据的可靠性？例如，样品收集时需要遵循哪些步骤？运输过程中是否需要冷冻样品？需要什么样的温度来储存样品，样品可以储存多长时间？
对已验证的方法进行更改时，申办者应进行额外的验证（即，部分验证或交叉验证）。
符合目的（fit-for-purpose ，FFP）的概念指出，验证的水平应适合研究的预期目的。上述列出的关键问题应该相对于药品开发阶段进行评估。在NDA、BLA或ANDA中的关键研究（如，BE或药代动力学研究），需要做出批准、安全性或标签的决定，应该包括充分验证的生物分析方法。不用于支持监管决定的探索性方法（如，候选人选择）可能不需要这样严格的验证。 该“符合目的”的概念适用于药品、代谢物和生物标志物。进行用于监管提交的毒理学研究的分析实验室应遵守21 CFR 58，良好实验室规范（GLP）。9 用于人体BA、BE和药代动力学研究的生物分析方法必须符合 21 CFR 320 “生物等效性和生物可用性要求”（即，21 CFR 320.29）中规定的标准。以下章节讨论了生物分析方法的开发、验证和研究中的使用，以及如何最好地记录验证方法和结果。本指南中使用的方法参数和分析术语的定义，请参见术语表。
III. 生物分析方法的开发和验证
A. 指导原则
生物分析方法开发的目的是确定方法的设计、操作条件、限制和适用性符合预期目标，并确保方法经过优化。在生物分析方法开发之前，申办者应该了解目标分析物（例如，确定药物的物理化学性质，体外和体内代谢，以及蛋白质结合）并考虑可能适用的任何已有分析方法的方面。方法开发和验证的要素和接受标准总结在表1中。表2描述了申办者如何记录生物分析方法的开发和验证，以及应该存储或提交的位置。方法开发包括提取和检测分析物有关的规程和条件的优化。 方法开发包括以下生物分析参数的优化（将在第III.B章节中详细讨论）以确保该方法适用于验证：
生物分析方法开发不需要大量的记录保存或注释。但是，申办者应该在开发生物分析方法的过程中记录规程的变更，以及任何问题及其解决方案，以便为方法开发过程中的任何变更提供依据。
生物分析方法验证表明，最优化的方法适合试验样品的分析。 申办者应该：
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对任何新的生物分析方法进行全面验证，以分析新药物实体、代谢物或生物标记物。
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对增加代谢物或额外分析物的现有已验证方法的任何修订，进行全面验证。
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在开始验证之前，为生物分析方法建立详细的书面描述（例如，方案、研究计划和/或标准操作规程（SOP））。描述应该确定从采样时间到分析时间，控制方法中的关键参数（例如，环境、基质、规程变量）的规程，以尽量减少它们对基质中分析物测量的影响。
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记录和报告（在方法验证报告中）用于声明或得出“该方法有效性”结论的所有试验。
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验证生物基质中每种分析物的检测结果。表1具体列出了每个生物分析参数的具体要求和接受标准。
B. 色谱分析（CC）和配体结合分析（LBA）的生物分析参数
下面讨论适用于CC和LBA的生物分析参数。单独针对CC或LBA的问题已具体指出。
1. 对照标准物质和关键试剂
申办者应对所有对照标准物质和关键试剂（如，抗体、标记的分析物和基质）进行适当的特征描述和记录（如，确定鉴别、纯度和稳定性），并将其存储在特定的条件下。用于制备校正标样和质控样品的对照标准物质的纯度会影响试验数据。因此，申办者应使用具有已知鉴别和纯度的已认证对照标准物质来制备已知浓度的溶液。对照标准物质应与分析物相同；然而，当这种情况不可行时，申办者可以使用已知纯度的已建立的化合物形式（例如，游离碱、游离酸或盐）。对市售可得的标准物质，申办者应提供分析证书（CoA），包括来源、批号和有效期日期（美国药典（USP）标准品例外）。对于没有CoA的内部或外部标定的标准物质，除了来源和批号外，申办者还应提供标准品鉴别和纯度的证据。使用超出有效期的标准物质时，申办者应提供最新的CoA或重新确定标准物质的鉴别和纯度。如果标准物质超出有效期，申办者不应该使用这批标准物质配制储备液，除非重新建立标准物质的纯度。对于内标（IS），如果证明IS适用于特定用途（例如，对分析物没有干扰），则申办者不必提供CoA或纯度证明。申办者应适当地表征和记录关键试剂（即，确定其身份、纯度和稳定性），包括但不限于任何标准物质、抗体、标记的分析物和基质。当关键试剂发生变化时，分析验证非常重要，如批次间变化或换为其他试剂。例如，如果标记的分析物、检测试剂或抗体发生变化，申办者应该：
2. 校准曲线
在方法开发过程中，申办者应根据特定试验中预期的浓度范围选择方法定量范围和校正标样的浓度。对于LBA，除了校正标样外，定量范围之外的锚定点可以帮助拟合曲线。不应将锚定点用作运行接受标准的一部分。对于大多数LBA，校准（标准）曲线本质上是非线性的，并且通常，LBA需要比CC更多的校正标样来定义校准曲线范围内的拟合。另外，LBA标准曲线的响应 – 误差关系是平均响应的变量函数（即，变异性heteroscadisticity）。申办者应使用充分描述浓度 – 响应关系的最简单模型，以及适当的加权方案和回归方程。对于LBA，浓度 – 响应关系通常适合采用四参数或五参数回归模型，但也可以评估其他模型。当方法验证时，校准曲线应该是连续的和可重现的。申办者应该使用与预期试验样品相同的生物基质制备校准标准。试验样品可能含有多个分析物。申办者应该为样品中的每个分析物生成校准曲线。当需要替代基质时，申办者应该证明和验证校准曲线。表1列出了校准曲线的要求，包括LLOQ，ULOQ和接受标准。
3. 质控样品
质控样品用于评估方法的精确度和准确度以及样品的稳定性。申办者应该使用与已验证的方法待分析的试验样品相同的基质来制备质控样品。在方法开发过程中，建议使用新制备的质控样品进行精密度和准确度分析，因为此时通常尚未产生稳定性数据。在方法验证期间，质控样品用于评估方法性能和分析物的稳定性。在验证运行中包括性能质控样品，以确定方法的精密度和准确度（见第III.B章节）。稳定性质控样品评估分析物在各种应力条件下的稳定性（关于质控样品浓度的选择，请参见第III.B章节）。质控样品的配制应该与校正标样使用不同的储备液。然而，如果申办者可以证明使用由不同储备液制备的校正标样和质控样品、在一次验证运行中的精密度和准确度，那么申办者可以在随后的运行中使用由该储备液制备的校正标样和质控样品。申办者应该在没有干扰或基质效应的大量空白基质中制备校正标样和质控样品。
4. 选择性和特异性
在方法开发过程中，申办者应确认被测物质是目标分析物，以尽量减少或避免干扰。该方法的选择性通常通过分析多个来源的适当生物基质（例如，血浆）的空白样品而被证明。根据方法的预期用途，可以在选择性评估中包括溶血样品、高血脂样品或来自特定人群的样品的影响。当使用液相色谱/质谱（LC / MS）方法时，申办者或申请人应确定基质对离子抑制、离子增强或提取效率的效应。应该评估内标以避免干扰分析物。生物基质中潜在的干扰物质包括内源性基质成分，如代谢物，分解产物 - 以及实际试验 – 同时服用药物和其他外援物。如果在样品采集期间使用稳定剂或酶抑制剂，申办者应评估对分析物定量产生干扰的可能性。申办者应该对方法开发过程中评估这些（以及其他任何潜在干扰）的需求做出合理性依据。在验证过程中，申办者应确认该方法不含潜在的干扰物质，包括内源性基质成分、代谢物、预期的同时服用药物等。如果试验样品含有多个分析物，并且分析物旨在通过不同的方法进行定量，申办者应该检测每种方法是否受到其他分析物的干扰。申办者应分析至少6个（对于CC）或10个（对于LBA）个体来源的适当生物基质（例如，血浆）的空白样品。申办者应确保在整个方法的应用过程中不存在基质效应。关于选择性和特异性要求和接受标准的细节，请参见表1。对于LBA，研究来源于结构或生理学相似分析物（即，外源性干扰）或基质效应（即，内源性干扰）的干扰是非常重要的。研究外源性干扰涉及确定可能干扰结合相互作用的分子的交叉反应性，包括与药物、任何代谢物、同时服用药物（及其重要代谢物）或内源性基质组分结构相关的分子。申办者应单个评估每个因素，并结合目标分析物来确定其引起干扰的能力。基质效应评估涉及将多个来源的生物基质的标准曲线与平行基质（用于评价方法重现性的连续稀释）和非特异性结合基质的标准曲线进行比较。申办者应该消除或减少任何重大干扰。如果这种尝试不成功，申办者可以考虑开发正交方法以消除或最小化干扰。在分析方法中可能发生样品之间的残留。申办者应在方法开发过程中消除任何残留。如果无法消除残留，申办者应评估方法验证期间的残留对试验样品浓度准确度的影响。
5. 灵敏度
定量下限 （LLOQ）确定了方法灵敏度，应在方法开发过程中确定。应开发和验证该方法，使其能够满足预期研究样品所需的要求。LLOQ评估可以单独完成，也可以作为校准范围精密度和准确度评估的一部分。表1列出了验证灵敏度的具体要求。
6. 准确度，精密度和回收率
在方法开发过程中评估定量范围内的准确度和精确度对于确定该方法是否可以进行验证并涉及分析在整个检测范围内多个浓度的重复质控样品是至关重要的。具体而言，申办者应评估在定量下限、低、中、高质控样品（以及LBA方法的定量上线）的性能，以确定该方法是否适合分析研究样品。用于估算准确度和精密度的方法验证试验应包括在多天内进行的最少三次（对于CC）和六次（对于LBA）的独立运行（即，精密度和精确度（A＆P）运行；参见表1）。每次A＆P运行应包括1条标准曲线和重复分析的多个质控样品浓度。申办者应该根据A＆P运行中质控样品的性能确定方法的准确度和精确度。表1列出了准确度和精密度以及A＆P运行的具体验证要求。申办者应在所有A＆P运行中使用新制备的校正标样和质控样品。在所有A＆P运行中最好使用新鲜制备的质控样品；然而，如果这不可能，申办者应该在一次或多次A＆P运行中使用新制备的质控样品。申办者应优化分析物的回收率以确保提取效率和重现性。回收率不一定是100％，但是分析物和内标回收的程度应该是一致的和可重现的。申办者应通过比较提取样品的分析结果和空白中加入提取后分析物的相应提取物（即，代表100％的回收率），进行回收率实验。回收率评估对于LBA不是必需的，除非涉及样品提取。回收率试验应按照表1中的描述进行。
7. 稳定性
在方法开发过程中，申办者应确定给定基质中分析物的化学稳定性，包括样品收集、处理和分析物储存的影响。申办者应评估自动取样器、实验台、处理或提取过的样品、冻融，储备液和分析物的长期稳定性。申办者应评估与试验样品相同基质的稳定性; 然而，当基质很稀少时，申办者可以探索使用合适的替代基质。对于复方给药，或特定药物方案的药物，应在其他药物的存在下评估分析物的稳定性。申办者还应该考虑在研发的药物适应症下，通常已知患者同时服用药物的情况下分析物的稳定性。根据分析物以及采样和分析条件，在方法开发过程中评估分析物在全血中的稳定性可能是有用的。例如，药物可能在全血中不稳定或在采样期间吸附到细胞组分。在验证过程中，稳定性评估应涵盖在分析场地接收之前的预期样品条件（例如，在临床场地、运输过程中和所有其他二级场地）以及在分析站点接收和分析期间的收据。生物液体中药物稳定性的验证是储存条件、药物的物理化学性质、基质和容器系统的作用。分析物在特定基质和容器系统中的稳定性仅与该基质和容器系统有关，不应外推至其他基质和容器系统。如果储存条件改变或在经验证的储存条件之外进行样品分析，则应在新条件下重新建立稳定性。如有必要，应对全血中分析物的稳定性进行重新验证（例如，如果分析物在采血过程中不稳定）。表1列出了稳定性的具体要求和接受标准。与基质相关的稳定性试验应将稳定性质控样品与新制备的质控样品新做出的标准曲线比较。尽管最好使用新制备的校正标样和质控样品，但在某些情况下（例如，对于大分子），可能需要过夜冷冻。在这种情况下，申办者应提供合理性依据并证明冻融稳定性。所有稳定性检测（参见下面的列表）应该使用在适当的无分析物、无干扰的生物基质中、由新鲜分析物储备液制备的分析物制备的一组样品。
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自动取样稳定性：只有当自动进样器储存条件不同或未被提取（或经过处理的样品）的稳定性覆盖时，申办者才应证明提取物在自动进样器中的稳定性。
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实验台稳定性：申办者应确定样品在试验样品预期实验室处理条件下的稳定性（例如，样品保存在室温下或在冰桶中的稳定性）。
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提取（或经过处理的样品）的稳定性：申办者应评估经过处理的样品稳定性，包括与新鲜制备的校正标样相比，在自动取样器中的停留时间。
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冻融稳定性：申办者应在最少三次冻融循环后评估样品的稳定性。质控样品应按照与试验样品相同的规程融化和分析。质控样品在两个循环之间应冷冻至少12小时。应将冻融稳定性质控样品与新鲜制备的校准曲线和质控样品进行比较。
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长期稳定性：申办者应确定样品在一段时间内的长期稳定性，该时间段等于或超过首次采样和最后一次样品分析的日期。试验用储存温度应与用于储存试验样品的温度相同。长期稳定性质控样品应与新制备的校准曲线和质控样品进行比较。在零下20ºC时测定稳定性可以覆盖较低温度下的稳定性。
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储备液稳定性：不应采用即将到期的标准物质制成储备液，除非储备液中分析物的纯度被重新确定。当储备溶液以不同的状态（例如，溶液对固体）存在，或与认证的标准物质有不同的缓冲液组合（对于大分子通常是这种情况），申办者应该有储备液的稳定性数据，以证明储备液储存稳定性。
8. 稀释效应
如果该方法用于检测稀释的样品，应在验证期间监测稀释可靠性 通过用类基质（like matrix）稀释定量上限（ULOQ）以上的质控样品以使其在定量范围内，并且应证明这些稀释的质控样品的准确度和精确度。在验证过程中使用的稀释应该模拟试验中预期的稀释。应该在LBA中证明前带效应。参见表1的具体要求和接受标准。
9. 部分和交叉验证
部分验证用于评估已验证的生物分析方法的修改。部分验证的范围可以从一个批内（intra-assay）准确度和精密度测定到几乎完整验证。根据要求，部分验证的原始数据应保存在分析场地以供检查。属于该类别的典型生物分析方法修改或变化包括但不限于以下内容：
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在收集生物液体时抗凝剂的变化（例如，肝素转为EDTA，但是平衡离子不变）
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物种内基质的变化（例如，从人体血浆转换为人体血液）或基质内物种的变化（例如，从大鼠血浆转换为小鼠血浆）
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LBA关键试剂的变化（例如，批次间变化、试剂变化）
b. 交叉验证
交叉验证是对两种或多种生物分析方法或技术的验证参数进行比较，用于在同一试验或不同试验中生成数据。此外，在单个试验中的样品分析在多个场地或多个实验室进行时，交叉验证是必要的。在这种情况下，应采用共同基质的质控样品和未混合的受试者样品在每个场地或实验室进行交叉验证，以确定实验室间的可靠性。当体积不足时，可以使用混合样品。在SOP或验证计划应该预先确定标准。
C. 验证方法：试验分析和报告的预期
本节介绍了使用已验证的生物分析方法进行常规药物分析的预期。表1列出了具体要求和接受标准。
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如果评估系统适用性，应使用特定的SOP。应使用独立于当前试验校正标样、质控样品和试验样品的样品确定系统适用性，包括仪器条件和仪器性能。应保持系统适用性记录，以供审计。
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在所有分析运行中应包含标准曲线和质控样品（详见表1）。质控样品应涵盖预期试验样品浓度范围。
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通常，在验证过程中确定的曲线拟合、加权和拟合优度应该在试验中的校准曲线使用。验证和试验样品分析之间的响应- 函数关系的变化表示潜在的问题。应该预先制定SOP以解决这些问题。
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总的质控样品应至少占总样品数量的5％，或至少6个（低、中、高质控样品，两份重复），以较高数量为准（参见表1）。应该在一次运行的所有不同分析批中中使用重复的低、中、高质控样品。
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如果试验样品浓度聚集在标准曲线的较窄范围内，则应增加额外的质控样品以覆盖样品范围。如果在试验之前，额外的质控样品浓度没有包括在已验证的质控样品范围内，则应在继续分析之前证明额外质控样品的准确度和精确度。如果部分验证是可接受的，那么已分析过的样品不需要重新分析。
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在处理和分析过程中，质控样品应该与试验样品分开进行。
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在每次分析过程中，应确认在定量下限（LLOQ）没有分析物干扰（参见表1选择性和灵敏度）。
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如果不符合校准和/或质控样品接受标准，则分析运行失败（参见表1）。
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在试验样品分析过程中，应将包含符合接受标准的分析运行的质控样品结果（包括异常值）纳入准确度和精密度的评估中。应报告所有分析运行的质控样品结果（合格和不合格），但不合格运行的质控样品结果不需要作为准确度和精密度估算的一部分。
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如果生物分析方法需要将整个分析运行分为不同的分析批（例如，在明显不同的时间、不同的分析员处理的样品组），则每个不同批次应处理所有水平的重复质控样品（例如低、中、高）以及试验样品。例如，当样品数量超过96孔板的容量或固相提取歧管不能容纳所有样品时。请参见表1了解基于质控样品接受标准的可接受运行。在不符合质控样品接受标准时，分析运行中的不同批次或批次可能会被拒绝，但是剩余批次可能合格，因为分析运行符合整体质控样品的接受标准。
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试验定量下限（LLOQ）以下所列浓度的试验样品应报告为低于LLOQ（BQL）。试验浓度高于定量上限（ULOQ）的样品应稀释并重新分析，或应扩展标准曲线并重新验证。
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试验样品稀释液应使用相同的基质（例如，人体血浆至人体血浆）。
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生物基质中一个分析物在所有试验样品的检测应在稳定性数据涵盖的时间段内完成。如果样品处理条件发生变化或超过有效的稳定性数据，则应在新条件下确定样品的稳定性。
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对于CC，应该监测内标响应的变异性。SOP应该预先行设定，以解决内标变异性的问题。
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应该监测漂移，并且如果它对未知样品浓度评估准确度有影响的话（例如漂移对散布的质控样品的准确性的影响），应该解决。
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所有来自一个受试者的试验样品应该在一次运行中分析，特别是针对个别受试者重复检测的试验设计（例如，BE试验所需的交叉或顺序设计）。如果采取其他方法，申办者或申请人应该证明该方法合理，并采取措施减少州期间的变异性。
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应该监测残留，如果有的话，应解决其对试验样品定量分析的影响。
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应进行用于评价方法重现性的试验样品再分析（ISR）（见第IV节表1和表2）。
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应预先确定描述重新分析原因的SOP或指南。重新分析仅适用于系统原因（例如，样品高于定量上限ULOQ、样品处理错误、设备故障、色谱分析不良）。SOP应包括重新分析的接受标准，申办者或申请人应报告最终值。具体要求如表1和表2所述。重新分析和报告的基本原理、方法和所有数据应清楚记录。
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对于涉及多个分析物的试验样品，不能因为一个分析物不符合接受标准而拒绝另一个分析物的有效结果。
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如果在人体试验中发现独特或不成比例的高浓度代谢物，则可能需要根据活性、针对代谢物开发完整验证的检测方法，（参见FDA行业指南“药物代谢物安全性检测” 10 )。
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应预先建立CC样品数据重新积分的SOP或指南。本SOP或指南应确定重新积分的标准以及重新积分如何进行的方式。重新积分的理由应该清楚地描述和记录。应该保持审计追踪。原始和重新积分的数据应该记录并报告。
