前言  作为一名质量分析人员，在分析方法开发、转移或确认中，难免会遇到一些问题如色谱峰分叉、分析方法不能重现等，而导致这些问题的原因如溶剂效应、缓冲盐选择不恰当、色谱柱不合适等。笔者分享一个具体的案例。

最近，笔者在检测某药物（复合物碱（M）+酸（N））中的残留溶剂（三氟乙酸）时发现，单独进三氟乙酸对照品是一个峰，进系统适用性溶液（三氟乙酸+样品）时发现三氟乙酸的色谱峰分叉，考虑是样品原因引起的（主成分的色谱峰已经是平顶峰）。

其实验条件如下：流动相（A）0.07%磷酸（PH3.0），流动相（B）甲醇；洗脱梯度：0-6min，100%A；6.01-20min，90%-50%A；20.01-30min，100%A；色谱柱：Ultimate AQ-C18；检测波长：210nm；柱温30℃；进样量20µl；三氟乙酸储备液为1.5mg/ml，三氟乙酸对照溶液0.15mg/ml；系统适用性溶液：供试品0.2g，先用纯化水溶解，再加三氟乙酸储备液，然后定容至20ml。

1、调查不同样品量对三氟乙酸色谱峰的影响

实验过程：分别取样品约0.02g、0.05g、0.1g、0.2g置于20ml容量瓶中，加适量纯化水溶解，各加三氟乙酸储备液2ml，然后分别定容至刻度，进样分析（色谱条件同上），结果如下图。

从图1中可以看出，当加入样品的量为0.1g时，三氟乙酸色谱峰的峰形已经略有变化（峰变宽且略有拖尾）；当加入样品的量为0.2g时，三氟乙酸的色谱峰分叉。

一般来说，只要样品样品中各个成分的重量不要过多（通常对于4.6mm内径的柱子进样量＜500µg），每个峰带在柱子内的移动就不会受样品中其它峰带的影响。因此，样品中单个化合物的重量，往往决定了化合物是否会超载，峰形是否改变，而与样品总量无关。

当加入样品的量为0.1g时，，主成分的色谱峰为平顶峰，虽然色谱峰超载，但并没有影响其它组份的分离；当加入样品的量为0.2g时，三氟乙酸色谱峰的分离受到影响。实质上是样品和稀释溶剂组成三氟乙酸的稀释剂，供试品与溶剂组成的溶液的PH与流动相不同，也就是三氟乙酸在稀释剂中的电离状态与流动相中的状态不同，供试品浓度越大，影响越大。因此可以减少样品量来解决这个问题。

2、考察不同稀释剂对三氟乙酸色谱峰的影响

实验过程：取样品约0.2g置于20ml容量瓶中，分别加适量纯化水、PH3.0流动相、0.1%磷酸溶解，各加三氟乙酸储备液2ml，然后分别定容至刻度，进样分析（色谱条件同上），结果如下图。

从图中可以看出，在加入样品量为0.2g时，通过调节稀释剂对三氟乙酸色谱峰的峰形有所改善。

通常情况下，样品溶剂比流动相弱，进样体积不会对峰宽和分离度造成负面影响；相反，样品溶剂比流动相强时，往往会使色谱图中较早流出的色谱峰扭曲变形或峰宽加宽。用流动相作为稀释剂，得到的峰形相对较好，是因为三氟乙酸在稀释剂和流动相中的电离状态较为一致；0.1%磷酸作为稀释剂，三氟乙酸部分质子化，在稀释剂中的状态与流动相中的状态不一致。

3、考察不同流动相PH对三氟乙酸色谱峰的影响

实验过程：流动相（A）为0.07%磷酸，调节PH为6.0（三乙胺调节）；取样品约0.2g置于20ml容量瓶中，加适量流动相溶解，各加三氟乙酸储备液2ml，然后分别定容至刻度，进样分析（色谱条件同上），结果如下图。

从图中可以看出，通过调整流动相的PH可以明显改善三氟乙酸色谱峰的峰形，主要原因是通过增加流动相的PH减弱主成分对三氟乙酸的影响，增加了化合物与色谱柱之间的作用力，从而增强了色谱柱的筛选作用。其主要原因是流动相中的三乙胺与色谱柱上的固定相作用，然后再与三氟乙酸作用，形成离子对作用，所以图中三氟乙酸色谱峰保留时间增长，但基线较差，是因为离子对效应，平衡时间短。

4、将0.07%磷酸改为20mM磷酸二氢钾（PH6.0）

实验过程：流动相（A）为20mM磷酸二氢钾，调节PH为6.0（氨水调节）；取样品约0.2g置于20ml容量瓶中，加适量流动相溶解，各加三氟乙酸储备液2ml，然后分别定容至刻度，进样分析（色谱条件同上），结果如下图。

从图中可以看出，将0.07%磷酸（PH6.0）改为20mM磷酸二氢钾（PH6.0）后，三氟乙酸色谱峰仍然分叉（样品与对照），主要原因是流动相缓冲能力不足引起的。

5、将0.07%磷酸改为20mM磷酸二氢钾（PH3.0）

实验过程：流动相（A）为20mM磷酸二氢钾，调节PH为3.0（氨水调节）；取样品约0.2g置于20ml容量瓶中，加适量流动相溶解，各加三氟乙酸储备液2ml，然后分别定容至刻度，进样分析（色谱条件同上），结果如下图。

从图中可以看出，将0.07%磷酸（PH6.0）改为20mM磷酸二氢钾（PH3.0）后，三氟乙酸色谱峰仍然分叉（样品与对照），主要原因是流动相缓冲能力不足引起的。

综上所述，流动相的PH和稀释剂可以显著影响色谱峰的峰形，因此在平时实验中要注意稀释剂效应和流动相的缓冲容量。

总结 

（1）在整个实验过程中，样品始终具有溶剂效应；

（2）调整流动相的PH可以改变样品进样量，并且影响色谱峰的峰形；

（3）使用流动相作为稀释剂可以改善色谱峰的峰形。