无菌检查试验

1、无菌检查适用于什么样品？

无菌检查法用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器械、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。若供试品符合无菌检查的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。

2、进行无菌检查时对检测环境有什么要求？

无菌检查应在无菌环境下进行，试验环境必须达到无菌检查要求，检验全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及受控环境应定期按医药工业洁净室悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。日常检验需对试验环境进行监测。

3、无菌试验需要用到什么培养基，培养基要符合什么要求？

无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。培养基适用性检查可在供试品的无菌检查前或者与供试品无菌检查同时进行。

4、方法适用性试验是什么？与无菌检查有什么关系？

进行产品无菌检查时，应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的无菌检查。若检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，应重新进行方法适用性试验。

5、方法适用性试验

菌种制备

注：中国药典中方法验证试验与培养基灵敏度检验所用菌种区别：大肠埃希菌代替铜绿假单胞菌。

检测方法

（1）薄膜过滤法

按供试品的无菌检查的要求，取每种培养基规定接种的供试品的总量，按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入不大于100 cfu的试验菌，过滤。加培养基至滤桶内，接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌的滤筒内加硫乙醇酸盐流体培养基；接种枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉的滤筒内加胰酪大豆胨液体培养基。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置规定温度培养，培养时间不得超过5天。

（2）直接接种法

取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基6管，分别接入不大于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的胰酪大豆胨琼脂培养基6管，分别接入小于100cfu的枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各2管，其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另一管作为对照，置规定的温度培养，培养时间不得超过5天。

结果判断

与对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以忽略不计，照此检查法和检查条件进行供试品的无菌检查。

如含供试品的任一容器中微生物生长微弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在检验条件下有抑菌作用，可采用：

a) 增加冲洗量，或增加培养基用量。

b) 使用中和剂，或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌作用，并重新进行方法验证。

注: 方法适用性试验可与供试品无菌检查同时进行。

6、供试品无菌检查

阳性对照

a) 无抑菌作用或抗革兰氏阳性菌：金黄色葡萄球菌

b) 抗革兰氏阴性菌：大肠埃希菌

c) 抗厌氧菌：生孢梭菌

d) 抗真菌：白色念珠菌

菌液制备同方法适用性试验，加菌量小于100cfu，培养不超过5天，应生长良好。

阴性对照

a) 薄膜过滤法：相应的溶剂和稀释液、冲洗液同法操作

b) 直接接种法：采用未接种的培养基

阴性对照不得有菌生长。

检测方法

无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。只要供试品形状允许，应采用薄膜过滤法。进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和检验条件应与方法适用性试验确认的方法相同。检验数量由委托人指定。

（1）薄膜过滤法

薄膜过滤法应优先采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45 μm，滤膜直径约为50 mm。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量为100 ml，且总冲洗量不得超过500 ml，最高不得超过1000 ml以避免滤膜上的微生物受损伤。

（2）直接接种法

每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于15 ml，胰酪大豆胨液体培养基每管装量不少于10 ml。培养基的用量和高度同方法验证试验；每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。

培养观察

将接种供试品后的培养基容器培养不少于14天；接种生物制品供试品的硫乙醇酸盐流体培养基的容器应一份置30-35℃培养箱内培养，一份置20-25℃厌氧培养箱内培养。培养期间逐日观察并记录是否有菌生长。

如在加入供试品后或在培养过程中，培养基出浑浊，培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长，可取该培养液不少于1 ml转种至同种培养基中，继续培养不少于4天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。

结果判断

阳性对照应生长良好，阴性对照不得有菌生长，否则试验无效。供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判定符合规定；供试品管中任何一管显浑浊并确证有菌生长，判定不符合规定。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效：

a) 无菌检查试验所用的设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查法的要求；

b) 回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；

c) 阴性对照管有菌生长；

d) 供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。