由于常见的骨植入物术后感染引起的手术失败，光热疗法(PTT)和光动力疗法(PDT)因其对组织的非侵害性抗菌作用以及不会产生细菌耐药性而受到广泛关注。我们利用层层组装技术在AZ31镁合金表面通过叶绿素铜诱导Ca-P涂层，制备的涂层表现出良好的耐腐蚀性、抗菌活性和相容性。对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌率分别为99.9%和99.8%，光热转换效率高达42.1%。并提出了三重抗菌机制，包括光动力反应、光热反应和铜离子释放。

01研究内容简介

镁（Mg）及其合金具有可生物降解的优点，接近天然骨骼的弹性模块和优良的机械特性。它们的降解产物镁离子也是人体组织的生长所必需的元素。它们可以用作内固定骨植入材料，以用来避免二次手术。然而，过快的降解速度和抗菌性能的不足限制了镁合金在骨科中的应用。

通常，Ca-P 涂层具有优异的生物相容性和骨整合性，可用于减轻镁合金的降解速率。通过层层组装技术（LbL）制备的钙磷涂层具有可控性、功能性和分子识别性等优点，并且因其良好的附着力和均匀性而得到认可。然而，骨植入物术后频繁的感染成为最严重的并发症之一，并会导致植入手术失败和器官的感染。为了找到更好的解决办法，近年来光动力疗法（PDT）和光热疗法(PTT)已被用于光辐照治疗细菌感染和癌症，并由于其抗菌谱广，无微生物耐药性，抑菌速度快等优点受到人们的广泛关注。

叶绿素铜钠盐（SCC）是一种从叶绿素中提取的水溶性铜钠盐，具有良好的生物相容性，几十年来一直用作食用染料和伤口愈合促进剂。SCC的抗癌活性因其在PDT或PTT中的良好效果而受到纳米生物材料领域的密切关注。叶绿素铜是一类四吡咯化合物，由被取代基包围的含铜中心离子的平面卟啉核心组成。SCC中的卟啉环有26个p电子，是一个高度共轭的体系，这决定了SCC具有优良的电子转移能力、优异的热稳定性、强的光子吸收能力、高效的电子转移以及高感光性能，使其成为了负载在生物金属活性表面层中很有前景的光敏剂。另一方面，在SCC结构中心的铜离子的作用不容小觑。铜离子是不可缺少的对人体健康起着重要作用的微量元素并在人体酶中发挥重要作用，促进细胞呼吸、神经递质和肽激素的产生。除此之外，铜离子还具有良好的抗菌性。

因此，SCC可以提供三重抗菌活性，可以协同PDT、PTT和在脱金属反应后释放的铜离子。在这项研究中，采用LbL法在AZ31合金表面通过SCC诱导了10层Ca-P涂层，深入了解了涂层的形成、腐蚀过程和抗菌机制。制备的含铜(Ca–P/SCC)10涂层具有良好的耐腐蚀性、优异的抗菌性能，同时具有良好的生物相容性。

基于SCC在镁合金表面的抗菌应用前景，山东科技大学曾荣昌教授团队对“体外降解、光动力和光热抗菌活性的在AZ31镁合金表面叶绿素铜诱导的Ca-P涂层”进行了系统的研究，样品的形貌和组成通过场发射扫描电子显微镜（FE-SEM）与附属的能谱仪(EDS)、X射线衍射仪(XRD)、傅里叶红外光谱仪(FTIR)和X射线光电子能谱仪（XPS）进行表征。通过动电位极化曲线、电化学阻抗谱（EIS）和析氢实验来评估样品的腐蚀行为。采用火焰原子吸收分光光度计测定样品在模拟体液中不同浸泡时间下的铜元素含量。使用活/死细胞染色（MTT法）和平板计数法评价样品的体外细胞毒性和抑菌性能。获得的(Ca–P/SCC)10涂层表现出良好的耐腐蚀性、抗菌活性（尤其是在808 nm近红外光照射下）和生物相容性。

本研究表明，如图1所示，(Ca-P/SCC)10涂层的整体析氢体积（HEV）和析氢速率（HER）远低于AZ31基体，说明(Ca-P/SCC)10涂层有效阻断了溶液与基体之间的离子交换。样品在HBSS中浸泡至60小时，析氢速率（HER）会骤增，对比分析未经SCC诱导的钙磷涂层，其原因可能是在涂层的降解过程中卟啉脱金属反应释放的铜离子，这种情况逐渐导致(Ca-P/SCC)10涂层和AZ31基体中的Al-Mn和α-Mg相之间的电偶腐蚀增强。浸泡至大约200小时后，腐蚀产物的形成和样品的腐蚀达到平衡。

图1（a）AZ31基体和(Ca-P/SCC)10涂层在浸泡24、75、170和300 h后的HEV和（b）HER曲线及相应时刻的（c）(Ca-P/SCC)10涂层宏观形貌

不同浸泡时间的(Ca-P/SCC)10涂层的C1s、Cu2p和N1s的XPS光谱如图2所示。如图2a所示，C1s光谱在284.8、286.5 和288.4处有三个峰eV，对应于卟啉环和-COO-基团的C-C和C-N键。三个浸泡时间中的Cu2p光谱（图2b）显示了相同的铜离子峰和配位Cu，证实了SCC的脱金属反应的发生。即涂层在降解过程中存在SCC和发生脱金属反应的SCC。

然而，卟啉及其许多衍生物很容易与多种金属形成N-配位络合物，通过在核心内或核心上方形成r键将一个或两个吡咯-NH-质子去质子化。可以清楚地观察到三种类型的N峰，在浸泡75 h之前，发现吡咯峰不同程度地向左移动。且亚胺峰和吡咯峰面积不相等，吡咯峰面积在50 h时达到最大值，然后逐渐减小，直至与亚胺峰面积相等。金属配体的N峰的面积总是与其他两个N峰的面积成反比。这表明当脱金属卟啉结构的数量增加时，带有金属配体的卟啉结构的数量会减少。其原因可能是浸泡过程中涂层的降解。质子浓度未达到平衡，卟啉结构中的配位键不断变化。

图2（a、b、c）不同浸泡时间(Ca-P/SCC)10涂层C1s、N1s和Cu2p的XPS谱图（d）火焰原子吸收分光光度计法测定(Ca-P/SCC)10涂层中Cu元素的释放量

为了探究(Ca-P/SCC)10涂层的光敏性能，2',7'-二氯荧光素在不同照射时间下的荧光强度变化如图3a所示。808 nm NIR光照射15 min后，AZ31基体合金没有产生ROS，通过(Ca-P/SCC)10涂层产生的大量ROS表明具有良好的光敏性能，提供了PDT性能。图3b-e显示了(Ca-P/SCC)10涂层在808nm NIR光（1W/cm2）照射下的光热性能。(Ca-P/SCC)10涂层在空气和HBSS中的温度在15分钟内分别达到了87.4和58.5 °C；但AZ31基体的温度没有明显变化，这表明(Ca-P/SCC)10涂层具有良好的PTT能力。如图3d和e所示，(Ca-P/SCC)10涂层的温度在空气或HBSS中表现出稳定的“开关”行为，表明具有优异的光热稳定性。

图3（a）AZ31基体和(Ca-P/SCC)10涂层的ROS释放量;AZ31基体和(Ca-P/SCC)10涂层在（b）空气和（c）HBSS中的温度变化曲线;在（d）空气和（e）HBSS条件下(Ca-P/SCC)10涂层“开关”性能的温度变化曲线

相应的热像仪照片如图4所示，样品在空气中和溶液中释放的热量是均匀的，表明(Ca-P/SCC)10涂层的均匀性。

图4 (Ca-P/SCC)10涂层在空气和HBSS中被808 nm近红外光激发下15分钟内的热成像照片

通过平板计数法，我们测试了样品对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌活性（图5）。AZ31基体和(Ca-P/SCC)10涂层在黑暗中的抗菌性能如图5a所示，(Ca-P/SCC)10涂层对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率分别为93.9%和92.2 %，高于AZ31基体合金的51.6%和60.1%，表明在(Ca-P/SCC)10涂层降解过程中释放的铜离子对细菌具有良好的抑制作用。AZ31基体的抗菌性能可归因于腐蚀过程导致Mg2+离子释放和pH值升高。由于SCC的光敏性和(Ca-P/SCC)10涂层的降解，在可见光（1 W/cm2）的照射下可以释放ROS和Cu2+离子来灭活细菌。结果表明，(Ca-P/SCC)10涂层的抑菌率分别提高到99%和97.5%。而AZ31基体抗菌活性的增加可能归因于可见光下产生的高度局部化电场的等离子体行为。与(Ca-P/SCC)10涂层共培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在808nm 近红外光（NIR）照射下的抗菌效果分别达到99.8%和99.9%，表明Cu、PTT和PDT具有协同作用。

图5 样品（a）在黑暗、（b）可见光和（c）近红外照射下对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌率和菌落图像

(Ca-P/SCC)10涂层的三重抗菌机制的体外抗菌活性随着环境的变化而变化。实验证明了(Ca-P/SCC)10涂层的高效的三重抗菌抗菌（图6）特性，因此(Ca-P/SCC)10涂层有潜力成为抑菌活性生物材料的候选材料。

图6 (Ca-P/SCC)10涂层在不同环境下的抗菌机理示意图