新型冠状病毒（2019-nCoV）属于β属冠状病毒，有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径约为60~140nm。具有5个必需基因，分别针对核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）4种结构蛋白及RNA依赖性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因组构成核衣壳，外面围绕着病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基质蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。

实验室检查包括一般检查，病原学及血清学检查，胸部影像学检查等。病原学检查又包括核酸检测和抗原检测。

本文适用于以抗原抗体反应为原理，对鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子等上呼吸道样本中的新型冠状病毒(2019-nCoV )抗原进行体外定性的检测试剂的研发。

新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂盒（胶体金法）。根据《体外诊断试剂分类规则》，该产品按照第三类体外诊断试剂管理，分类编码为6840。

一. 新型冠状病毒（2019-nCoV）抗原检测试剂研发实验要求

1. 分析性能研究

开发人应采用在符合质量管理体系的环境下生产的试剂盒进行所有分析性能研究，确定具体研究方法、试验方案、试验数据、统计分析等详细内容。

如产品适用不同的机型，需要开展在不同机型上进行评估的研究。如产品包含不同的包装规格，需要对各包装规格进行分析或验证。对于不同的样本类型应分别开展相应的分析性能评估研究。配套的不同保存液或裂解液至少应进行检出限、精密度、包容性、干扰研究。

分析性能评估所用样本的基本信息均需明确，例如样本来源、样本类型、采集和处理方式、稀释方式、定值过程及数据等。研究中采用的新型冠状病毒样本，应采用合理方法对样本进行标定，包括拷贝数、Ct值、TCID₅₀值等。分析性能评估用样本应为真实样本或病毒培养物，如需稀释应采用阴性基质进行稀释。

建议着重对以下分析性能进行研究：

1.1、样本稳定性

应充分考虑实际使用过程中样本采集、处理、运输及保存等各个阶段的条件，对不同类型样本的稳定性分别进行研究。内容包括建议的保存条件、保存液、裂解液和运输条件（如涉及）等。如样本采集后需加入保存液、裂解液等，应同时对处理后的样本进行样本稳定性的研究。建议对不同的灭活方式进行验证。

1.2、 适用的样本类型

列明产品适用的样本类型。

1.3 、精密度

应对精密度指标，如标准差或变异系数等的评价标准做出合理要求。

应考虑运行、时间、操作者、仪器、试剂批次和地点等影响精密度的条件，设计合理的精密度试验方案进行评价。

设定合理的精密度评价周期，例如：为期至少20天的检测，具体方案可参考性能评价相关文件进行。

用于精密度评价的临床样本应至少包含3个水平：阴性样本、临界阳性样本、（中或强）阳性样本，并根据产品特性设定适当的精密度要求：

①阴性样本：待测物浓度低于检出限或为零浓度，阴性检出率应为100%（n≥20）。

②临界阳性样本：待测物浓度略高于试剂盒的检出限，阳性检出率应≥95%（n≥20）。

③中/强阳性样本：待测物浓度呈中度到强阳性，阳性检出率为100%且CV≤15%（n≥20）,或条带结果显色均一。

1.4 、包容性

使用具有时间和区域特征性的不同来源的至少10例样本进行验证，验证内容应包括重复性、检出限等，提供样本及浓度的确认方法、试验数据。样本应覆盖目前国内变异株的常见类型，以考察对不同变异株的检出能力。

1.5、 检出限

1.5.1、检出限的确定

建议对病毒进行梯度稀释后研究确定检出限，每个梯度的病毒稀释液重复3～5份，每份稀释液重复检测不少于20次，将具有95%阳性检出率的病毒水平作为检出限。

应分别选择不同来源具有代表性的3个样本进行检出限的确定。

1.5.2、检出限的验证

选择具有时间和区域特征性的至少3个样本（与检出限确定不同样本）在检出限浓度水平进行验证，应达到95%阳性检出率。

应提供详细的病毒滴度的确定方法，同时应详细描述病毒样本的确认方法及验证结果。

1.6、 分析特异性

1.6.1、交叉反应验证

地方性人类冠状病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）；SARS冠状病毒、MERS冠状病毒。

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季节性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，呼吸道合胞病毒A、B型，鼻病毒A、B、C组，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，肠病毒A、B、C、D组，EB病毒、麻疹病毒、人巨细胞病毒、轮状病毒、诺如病毒、腮腺炎病毒、水痘-带状疱疹病毒、人偏肺病毒。

肺炎支原体、肺炎衣原体、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌。

验证不少于20份正常人样本。

除SARS冠状病毒和MERS冠状病毒可采用重组蛋白外，各病原体均应采用临床样本或培养物进行验证。提供所有用于交叉反应验证的病原体样本的来源、阴阳性、种属/型别和浓度/滴度确认等试验资料。建议在病原体的医学相关水平进行交叉反应的验证，如病毒浓度为10⁵ pfu/mL或更高。

1.6.2、内源/外源物质干扰

建议在每种干扰物质的潜在最大浓度（“最差条件”）条件下进行评价，在病毒抗原临界阳性水平进行干扰试验验证。

表1 用于干扰试验的物质

1.7 、高剂量钩状效应

应评估高剂量钩状效应并开展研究。

1.8、根据主要原材料研究资料中的企业参考品设置情况，采用三批产品对企业参考品进行检验。

1.9 、反应体系

1.9.1、反应条件确定：开发人应考虑反应时间、判读时间、反应温度、洗涤液体积和洗涤次数（如涉及）等条件对产品性能的影响，通过试验确定上述条件的最佳组合。

1.9.2、反应体系中样本加样方式及加样量确定：通过试验确定最佳的加样方式及加样量。如样本需采取稀释或其他必要的方法进行处理后方可用于最终检测，还应对样本稀释液及其用量、其他必要的处理方法等进行研究。

1.9.3、采样拭子及样本保存液的选择：对拭子头和拭子杆的材质要求。明确保存液或裂解液的成分、浓度、使用量的要求等。

2. 稳定性研究

稳定性研究主要包括实时稳定性（有效期）、开瓶（开封）稳定性、高温加速破坏稳定性、运输稳定性等，开发人可根据实际需要选择合理的稳定性研究方案。对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究。

3. 阳性判断值研究

开展对申报试剂阴性/灰区/阳性等结果判断的阳性判断值（cut-off,CO）确定的研究。建立阳性判断值使用的样本来源的选择应考虑到不同的地理区域、不同的感染阶段和生理状态等因素的影响。如果产品适用不同样本类型，需要对所有样本类型进行阳性判断值的验证。

如适用，可采用受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve, ROC）的分析方式来选择确定合理的阳性判断值；如结果存在灰区（equivocal zone），应明确灰区建立的基础。如采用其他方法对阳性判断值进行确认研究，应说明这种方法的合理性。

4. 其他研究

4.1、主要原材料研究

此产品的主要原材料包括抗体、质控品（线）、参考品等。应对主要原材料的选择与来源、制备过程、质量控制标准等相关开展研究。如主要原材料为企业自制，应明确其详细制备过程；如主要原材料源于外购，应明确选择该原材料的依据及开展对比筛选试验、供应商提供的质量标准、出厂检验报告，以及检验该原材料到货后的质量，供应商应固定，不得随意更换。

4.1.1、新型冠状病毒特异的抗体

病原体特异的抗体是该类产品的关键原材料。在选择抗体原料时，应注重结合表位的选择，避免毒株间差异造成的假阴性，亦应考虑抗原在其他冠状病毒的表达情况，避免存在交叉反应出现假阳性。

应开展抗体来源、制备、筛选、鉴定及质量标准（外观、蛋白浓度、纯度、分子量、效价、功能性试验等）等试验。

自制抗体，如使用天然抗原作为免疫原，应明确该天然抗原的来源；如使用重组抗原或其他人工合成抗原作为免疫原，应明确相应的核酸或者蛋白序列信息。针对抗体的制备、鉴定等过程，应开展详细的研究和工艺稳定性验证。

外购抗体，应详述抗体的名称及生物学来源，供应商名称；开展供应商选择的研究及供应商出具的抗体性能指标及检验报告。

4.1.2、其他主要原材料

除上述主要原材料外，产品中包含的其他主要原材料，如二级抗体、胶体金、发光物、硝酸纤维素膜、微孔板、样本稀释液、提取液等，均应进行选择及验证。明确供应商和质量控制标准。

4.1.3、试剂盒质控品/质控线

产品应设置合理的质控品/质控线。质控品应至少包含阴性和阳性两个水平。对相关原料的来源、选择和性能确认等相关内容开展研究，明确供应商和质量控制标准。开发人应对质控品的检测结果做出明确的范围要求（试验有效性的判断）。

4.1.4、企业参考品

该类产品的企业参考品一般包括阳性参考品、阴性参考品、检出限参考品和重复性参考品。应根据产品性能验证的实际需要设置企业参考品。

应明确企业参考品的原料来源、选择、制备、阴阳性及浓度/滴度确认方法或试剂等相关验证。企业参考品应采用临床样本，或者使用病毒培养液加入阴性基质。企业参考品的设置建议如下：

4.1.4.1、阳性参考品

阳性参考品应考虑覆盖不同来源及特征的样本，可选择至少各5份确认为阳性的样本，并设置不同滴度水平。

4.1.4.2、阴性参考品

阴性参考品应考虑检测特异性的评价，建议包括冠状病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、流感病毒、肠道病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等抗原阳性样本。

4.1.4.3、检出限参考品

可设置系列稀释样本，其中应包含检出限水平。

4.1.4.4、重复性参考品

建议包括高、低两个浓度的样本，其中一个浓度应为检出限附近的浓度。

4.2、生产工艺的研究

4.1.1、明确产品基本反应原理。

4.1.2、明确主要生产工艺的依据。

4.1.3、应考虑如包被/标记液量、浓度、时间、条件等指标对产品性能的影响，通过试验确定上述指标的最佳组合。

4.1.4、显色系统、酶作用底物等的介绍以及最适条件研究。