在反相色谱中随着pH的增加，酸性化合物保留时间缩短，而碱性化合物延长；
缓冲液可以缓冲溶液pH的改变，缓冲液的定义是加入少量的酸或碱时能缓冲pH，就是说添加酸或碱时pH的变化很小。这个保持pH的能力就叫做缓冲能力，它是由缓冲液的浓度和缓冲盐的pKa决定的，缓冲盐在pKa附近的缓冲能力最大。表1列出的是液相中一些常用的缓冲盐的pKa。注意这是在水中测的，没有加有机溶剂。当加入有机溶剂时，pKa会有所变化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都会有一样的变化。
对于液相常用浓度来说，缓冲液应维持在缓冲盐的pKa的1.5个pH单位左右，当浓度特别稀的时候，如低于5mM，就要把范围缩小，大概+/-1个pH单位。
表1：常用缓冲盐的pKa值（25℃）
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缓冲盐 |
pKa |
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醋酸盐 |
4.75 |
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铵盐 |
9.24 |
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硼酸盐1 |
9.24 |
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硼酸盐2 |
12.74 |
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硼酸盐3 |
13.8 |
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柠檬酸盐1 |
3.13 |
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柠檬酸盐2 |
4.76 |
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柠檬酸盐3 |
6.4 |
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2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES) |
6.15 |
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草酸盐1 |
1.27 |
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草酸盐2 |
4.27 |
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磷酸盐1 |
2.15 |
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磷酸盐2 |
7.2 |
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磷酸盐3 |
12.38 |
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三氯乙酸 |
0.52 |
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三乙醇胺 |
7.76 |
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三乙胺 |
10.72 |
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三氟乙酸 |
0.5 |
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三羟甲基氨基甲烷(Tris) |
8.08 |
建议在开发方法的时候首先要选择缓冲盐和 pH范围，然后用溶液的选择性微调分离。这个策略快速而高效，而且可以让你避免陷入缓冲液pH的泥潭。
温度
1）建议温度设置在25℃-40℃，适当的柱温保持良好的保留时间的重现性，一定程度上提高柱效，增加分离度。
2）柱温过低，流动相的粘度下降，色谱柱的背压降低。
3）柱温太高，与检测器之间温差太大，使峰变形，加快离子对试剂或缓冲盐对硅胶基质的攻击，硅胶溶解，缩短色谱柱的寿命；柱温太低，使得需要制冷的柱温箱，硬件要求太高，不利于方法的推广。
4）温度的改变会导致保留时间漂移，如果仪器自动进样过夜或过周末，就会发现保留时间随着实验室温度的改变而产生漂移，显然这种问题用柱温箱就可以避免。
