导读

“魔法子弹”抗体偶联药物（Antibody-drug conjugate, ADC）无疑是近几年新药研发领域的热点，根据Evaluate Pharma和BCG的预测，到2024年，全球ADC市场预计将达到129亿美元，到2026年有望超过160亿美元[1]。随着ADC药物的大放异彩，一股“万物皆可偶联的浪潮”席卷而来，研究人员试图通过借鉴ADC的设计原理，将同样备受瞩目的新分子—蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimera, 简称PROTAC)与单抗进行连接，以提高PROTAC的体内递送效率，从而产生一种新的分子模式——抗体偶联降解剂(Degrader-antibody conjugates, DAC)。

DAC药物的作用机制和临床进展

靶向蛋白质降解（Targeted Protein Degradation，TPD）主要是通过降解目标蛋白来实现疾病的治疗。其中近年来发展最迅速的两种TPD技术分别是蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis Targeting Chimeras, PROTACs)和分子胶(Molecular Glues)，两种技术通过不同的作用机制降解目标蛋白。

PROTAC主要是由靶蛋白配体(Target Protein Ligand)、E3蛋白连接酶配体(E3 Ligase Ligand)和连接子(Linker)3个部分组成，其作用机制是，一端靶向配体与目标蛋白结合，另一端E3连接酶配体与细胞内的E3泛素连接酶结合，形成复合物，从而使目标蛋白被泛素化和蛋白酶体识别，最终被特异性降解[2](图1)。与传统药物相比，PROTAC是事件驱动，而非占位驱动，能够针对不可成药靶点，用量小，且细胞内可再循环，可以克服靶蛋白突变/过表达引起的耐药。然而，PROTAC并非完美，PROTAC的分子较大，因此会造成细胞透膜性及生物利用度的挑战，同时可能会发生脱靶毒性和体内代谢不稳定的问题。

图1. PROTACs的作用机制[2]

那么，能否参考ADC的设计原理，将抗体引入到PROTAC中，既保持PROTAC的优势，又同时改善PROTAC的问题？这就是DAC设计的初衷。DAC的作用机制与ADC相似，同样利用抗体靶向特定的细胞表面抗原，抗原-抗体结合后，抗体介导内吞至溶酶体中，增加PROTAC的生物利用度，在溶酶体中，DAC被降解后，释放PROTAC，从而发挥作用[3](图2)。 

图2. DAC的作用机制[3]

相较于ADC药物，DAC药物还处于未经充分验证的初步开发阶段，近年来才进入到人们的视野中。目前DAC药物在临床研究及合作的进展相对较少，Orum Therapeutics、百时美施贵宝(BMS)、C4 Therapeutics、默沙东(MSD)、Nurix和Seagen正在针对HER2、CD33、CLL1等多靶点进行DAC药物的研发(图3)[3]。

图3. DAC的临床研究进展及合作交易[3]

DAC药物的非临床药理药效评价

2022年10月31日，Orum Therapeutics的抗体-GSPT1(G1期至S期转变蛋白1, G1 to S phase transition 1)降解剂偶联物ORM-5029针对HER2阳性的晚期实体瘤，启动了I期临床试验。这也使得ORM-5029成为了首个进入临床阶段的DAC药物[4]。下文将以ORM-5029已经披露的数据为例，介绍DAC药物早期的非临床药理药效评价。

ORM-5029选择的靶点是GSPT1，GSPT1不仅在肿瘤细胞中发挥重要的生物学功能，在正常细胞的转录和调控中也发挥着重要的功能，所以如果是单纯靶向GSPT1的分子胶原料药CC-885可能会引起一些脱靶毒性，因此选用GSPT1靶点有助于验证DAC的概念。整个ORM-5029的研发流程可以主要分为以下四个步骤[5](图4)：

1. 降解剂的修饰和筛选：因为CC-885并没有和连接子连接的位点，所以需要对CC-885做一些修饰和筛选，筛选以对GSPT1的最大降解效率为标准，同时也会考虑在中性条件下的水溶性及与CRBN的结合能力，筛选出一类化合物，并通过HiBiT系统在体外进行降解动力学的研究，根据其降解动力学、水溶性及与CRBN/GSPT1形成三元复合物的稳定性，最终选择性能优越的SMol006作为候选目标化合物。

2. 抗体的选择和表征：为了选择作用靶点和适应症，用候选目标化合物对200多种细胞株进行敏感性测试，发现在HER-2阳性的乳腺癌和急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia, AML)上都有明显抑制效果，针对HER-2阳性乳腺癌，抗体部分选择了帕妥珠单抗，最终DAC药物由SMol006通过临床验证的Val-Cit-PABc连接子与帕妥珠单抗结合。

3. 概念验证：偶联形成DAC之后，检测DAC与CC-885和ADC药物T-DXd在不同HER-2表达水平的细胞株上的细胞毒性和体内抑瘤能力，在HCC1569动物模型上发现该DAC与SMoI006和载体对照组相比，能够显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存时间。

4. 药效学研究：进一步对候选DAC进行体内体外的药效学研究，包括瘤内降解水平、量效关系。

图4. ORM-5029的研发流程[5]

DAC药物药理药效评价的关注点

根据DAC药物研发的经验，药明康德生物学业务平台总结了DAC药物药理药效评价过程中4个阶段的主要关注点(图5)：

图5. DAC药物药理药效评价的关注点

1、降解剂的筛选和评价

· 二元/三元复合物的形成：即便已有现成的degrader如CC-885，同样需要对它们进行一些修饰和优化来增加连接子的连接位点，修饰后的degrader既带有连接子代谢的产物也会影响对目标蛋白、E3连接酶的亲和力，这些亲和力会影响二元/三元复合物的形成。其中，三元复合物的形成更受关注，它是蛋白降解剂发挥功能的主要作用形式，可以通过蛋白和细胞层面进行评价，要注意可能出现的钩状效应及钩状效应点，而在细胞层面不仅可以反应三元复合物形成，同时也可以侧面反馈出蛋白降解剂的透膜性[6]。

· 目标蛋白的降解：在细胞层面通常通过In Cell Western、Western Blot、或HiBiT等实验技术进行评价。

· 透膜性：有效的降解剂应具有良好的细胞透膜性，良好透膜性也是DS-8201能在临床上脱颖而出的很重要的因素，与传统的“魔法子弹“设想选用不可降解的连接子不同，选用能够降解的连接子并优化小分子药物的透膜性能够带来旁观者效应，从而带来更好的治疗窗口 。透膜性不仅可以通过前文细胞层面的试验反馈，也可以通过经典的Caco2 细胞模型和PAMPA方法等生物膜方法检测[7]。

图6. 降解剂的设计和筛选[6, 7]

2、抗体的选择和表征

· 抗体和抗原的相互作用：抗原抗体的亲和力会影响内吞的效率，可以通过基于蛋白层面的测试(如ELISA/SPR)和基于细胞层面的测试(如FACS)进行评价。

· Fc介导的活性：不仅与抗体依赖性细胞毒性(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity, ADCC)、补体依赖性细胞毒性(Complement-Dependent Cytotoxicity, CDC)及抗体依赖性细胞吞噬(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis, ADCP)有关，还与Fc受体介导的内吞有关， 内吞并不仅仅带来更多的抗肿瘤活性，同时，抗体偶联药物被肿瘤内巨噬细胞吞噬后，还可以在巨噬细胞富含蛋白酶的溶酶体中充分降解，并释放小分子药物，产生旁观者杀伤效应。

· 内化和定位：内化的效率和内化后的定位非常重要，内化后需要定位在溶酶体中，并且停留足够长的时间才能够发挥作用。内化效率可以通过FACS，Incucyte进行动力学的检测，而Confocal则可以用于亚器官的定位。

图7. 抗体的选择和表征

3、概念验证

在DAC的概念验证阶段，非常重要的一点是检测目标蛋白的降解是否是抗原依赖的，这一点能够验证DAC的作用机制。如图8A所示，对BRD4 DAC药物进行了检测，可以观察到其在HER2+的细胞中HER-2依赖性的降解，而在HER2-的细胞中降解较低。通过流式细胞术和CTG等常规方法可以进一步检测到细胞的凋亡(图8B, C)。另外，也可以通过体外的一些方法进行旁观者效应的检测(图8D)。在体内层面，需要验证DAC药物的作用机制，如DAC相比于等量的degrader，在体内具有更好的抑瘤活性及DAC药物量效关系(图9)[5]。

图8. DAC的体外概念验证

图9. DAC的体内概念验证[5]

4、药效学/药物动力学

包括对DAC进行体内外的药效学、药物动力学研究、量效比的研究等。

结 语

作为一个新兴治疗模式，DAC药物展示出了与传统的ADC相比独特的作用机制和显著的靶向性。与常规的降解剂相比，DAC具有更强的递送能力、优秀的靶向性、独特的体内代谢机制以及更广阔的治疗窗口。相比较于ADC， DAC药物通过变更了payload端的作用机制，为抗体偶联药物的适应症拓展带来更多的可能性；同时payload端具有更强的选择性，也为抗体偶联药物带来更强的靶向性。随着研究的不断深入，我们相信在未来，DAC药物会在更多的疾病领域和适应症中发挥更大的作用，造福更多病患。

参考资料：

医药生物：从ADC到XDC，靶向化疗迈入新时代-ByDrug-一站式医药资源共享中心-医药魔方, www. pharmcube.com

J Med Chem, 2018

Ki Bum Hong, 2023

34.6亿美元：Seagen与Nurix合作开发降解剂偶联抗体药物, www.xueqiu.com

AACR 2023

Pettersson M, 2019

Promega Corporation