间接竞争ELISA是一种基于抗原-抗体特异性结合的免疫检测技术，用于检测样品中微量的小分子抗原或半抗原。

在该实验中，先将已知抗原包被在酶标板的微孔表面，然后加入待测样品和一定量的抗体。如果样品中含有目标小分子（抗原），这些小分子会与包被在板上的抗原竞争有限的抗体结合位点，从而抑制抗体与包被抗原的结合。接着加入酶标二抗，与结合在包被抗原上的抗体结合，通过酶催化底物产生显色反应，根据颜色的深浅来定量分析样品中目标小分子的含量。

由于样品中目标小分子的量与最终的颜色信号成反比，所以通过测量吸光度值可以间接反映出样品中目标小分子的浓度。 

一、实验前准备

1、试剂选择

（1）包被抗原：选择具有良好免疫原性和特异性的抗原，它将作为固相载体上的捕获分子，决定着整个实验的特异性和灵敏度。因此尽量使用高纯度的抗原，可通过亲和层析、离子交换层析等方法纯化。如果是自己制备的抗原，要确保其结构完整，避免变性。例如，对于蛋白类抗原，可使用SDS-PAGE和Western blot来鉴定其纯度和分子量。保存抗原时，根据其稳定性选择合适的保存条件，一般在-20℃或-80℃，避免反复冻融。

（2）抗体是间接竞争ELISA的核心试剂，与抗原的亲和力和特异性直接影响实验结果。因此可以使用单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体特异性强，批间差异小；多克隆抗体可能具有更好的亲和力，但特异性相对稍弱。选择时根据实验要求权衡。保存抗体时，遵循供应商的建议，一般在4℃短期保存或-20℃长期保存，避免反复冻融。可将抗体分装成小份，使用时取出一份，减少因反复冻融导致的活性下降。

（3）酶标二抗：酶标二抗与一抗结合，通过酶的催化作用产生可检测的信号。选择与一抗来源物种相匹配的酶标二抗，如一抗是小鼠来源的，可选择抗小鼠的酶标二抗。确保二抗的工作浓度经过优化，可通过预实验确定最佳浓度。购买高质量的酶标二抗，检查其保质期和保存条件，通常在4℃保存，并注意避免光照，因为一些酶（如HRP）对光敏感。

2、耗材准备

（1）酶标板：作为反应的固相载体，其质量会影响抗原包被效果和实验背景信号。优先选择质量可靠的品牌，如Costar、Nunc等。不同类型的酶标板（如聚苯乙烯、聚氯乙烯）可能对实验结果有影响，一般使用聚苯乙烯的高吸附板进行蛋白包被。在使用前检查酶标板是否有损坏或污染，可通过肉眼观察或用蒸馏水清洗后检测吸光度来判断。

（2）移液器和吸头：准确的加样对于实验结果的准确性至关重要。使用经过校准的移液器，定期检查和校准其准确性。使用合适量程的移液器，避免超量程使用。选择与移液器匹配的高质量吸头，确保吸头无RNase、DNase和内毒素，防止污染。 

二、实验操作

1、包被：将抗原固定在酶标板的孔底，为后续与抗体的结合提供结合位点。一般使用碳酸盐缓冲液（pH9.6）或PBS缓冲液（pH7.4）作为包被缓冲液，将抗原稀释至合适浓度（根据预实验优化，一般为0.5~10μg/mL）。每孔加入100μL抗原溶液，4℃过夜或37℃孵育2~4小时。包被后，用洗涤液（一般是含0.05%Tween-20的PBS）洗涤3~5次，以去除未结合的抗原。可以使用酶标仪检测OD值，判断包被效果，一般OD值在0.8~1.2之间较为理想。

2、封闭：封闭未被抗原占据的酶标板表面，减少非特异性吸附。常用的封闭剂有牛血清白蛋白（BSA）、脱脂奶粉等。使用1%~5%BSA或5%脱脂奶粉的PBS溶液，每孔加入200μL，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。封闭后彻底洗涤，确保去除未结合的封闭剂，以免影响后续的反应。

3、竞争反应：在样品和已知浓度的标准品中加入一抗，使它们竞争与包被抗原结合，样品中的目标分子会与标准品竞争结合抗体，从而反映样品中目标分子的浓度。准备一系列浓度的标准品溶液，涵盖预期的样品浓度范围。同时加入适量的一抗，一抗浓度根据预实验优化。一抗孵育时间和温度可根据抗体说明书和预实验调整，一般37℃孵育1~2小时或室温孵育2~4小时。包括阳性对照、阴性对照和样品孔，每个样品和标准品设多个复孔，以提高结果的可靠性。

4、酶标二抗孵育：使酶标二抗与一抗结合，为后续显色反应做准备。使用含0.05%Tween-20的PBS稀释酶标二抗，稀释倍数根据预实验确定，一般为1:5000~1:20000。每孔加入100μL酶标二抗溶液，37℃孵育1小时左右，然后充分洗涤，去除未结合的二抗。

5、显色和终止原理：通过酶催化底物产生颜色反应，终止反应后测量吸光度，反映目标分子的含量。若使用HRP标记的二抗，常用的显色剂是TMB底物，加入100μL，在室温或37℃避光显色10~30分钟，至颜色达到一定强度。使用2M硫酸终止反应，每孔加入50μL，终止反应后立即在酶标仪上读取450nm（或450/630nm双波长）处的吸光度。

三、实验数据分析

1、标准曲线绘制原理：根据标准品的浓度和相应的吸光度值绘制标准曲线，用于定量分析样品中的目标分子浓度。以标准品浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，使用软件（如GraphPadPrism、Excel）绘制标准曲线。通常使用四参数逻辑曲线（4PL）拟合，该曲线能较好地拟合间接竞争ELISA的数据。检查曲线的拟合度（R²值），一般要求R²>0.95，确保曲线的可靠性。

2、结果分析原理：根据标准曲线计算样品中目标分子的浓度。将样品的吸光度值代入标准曲线方程，计算出样品中目标分子的浓度。对于超出标准曲线范围的样品，需要稀释或浓缩后重新检测。分析数据时，计算样品浓度的平均值和标准差，评估实验的重复性和准确性。对于多组实验数据，可以使用统计分析软件（如SPSS）进行组间比较。 

四、常见问题及解决方法

1、高背景信号可能原因及解决方法

（1）封闭不充分：增加封闭剂的浓度或延长封闭时间，优化封闭条件。

（2）洗涤不彻底：增加洗涤次数或延长洗涤时间，确保洗涤液完全覆盖孔底，避免残留的试剂影响后续反应。

（3）酶标二抗浓度过高：降低二抗浓度，重新进行实验。

2、低信号强度或无信号可能原因及解决方法

（1）抗原或抗体失活：检查试剂的保存条件和有效期，使用新的试剂重新实验。

（2）包被效果不好：优化包被抗原的浓度和包被条件，如调整包被缓冲液、时间和温度。

（3）显色时间过短：适当延长显色时间，但要避免过度显色导致颜色过深，难以准确测量。