细胞计数在细胞实验中是非常常见的，大多数实验室目前使用细胞计数板进行细胞计数，细胞计数板的结构如下图所示：

实验步骤

1.所用细胞密度达到一定要求后进行细胞计数铺板，提前准备好细胞计数板、盖玻片、计数器。

2.弃掉原有培养基，加入1ml温浴的PBS缓冲液清洗。

3.弃掉PBS缓冲液，加入胰酶消化细胞，消化时间根据细胞类型及日常经验决定。

4.消化相应时间后，加入二倍体积的培养基终止消化，用移液器将细胞全部吹下，转移至离心管内。

5.离心机室温800rpm，离心5min。

6.准备和所计数细胞种类数相同的1.5ml Ep管，各加入PBS缓冲液980μl备用。

7.准备细胞计数板，并在计数区盖上盖玻片。

8.将5中离心结束的细胞弃上清，加入1ml培养基，充分混悬后取20μl加入到6中的Ep管中，充分颠倒混匀后取12μl加入牛鲍计数板一侧的计数区内，保证计数区充盈。

9.低倍显微镜（物镜4）下找到计数视野，上图中“B C D E”区为细胞计数区。

10.高倍镜（物镜10）下计数细胞，依次计数4个方格内的细胞数量。

11.计算细胞数量，假设4个方格内细胞总数为A，则每ml的细胞数量为：A/4×104×50（稀释倍数）=B个。

12.假设铺板所需细胞密度为1×104个/ml，则所需8中的细胞混悬液的量为：1×104×C（培养基所需毫升数，如6孔板每孔加培养基2ml）/B=D ml，最后换算成μl即可。

13.铺板：取C ml培养基，加入8中细胞混悬液D μl，充分混匀后依次加入培养皿中，放入细胞培养箱内即可。

常见问题及注意事项

1.镜下计数细胞时，压线细胞按照“计上不计下，计左不计右”的原则进行，若有少量成团细胞，则按1个细胞处理，若成团细胞太多，说明在步骤8中，细胞混悬不彻底，未能彻底分开成单细胞，因此需重新进行上述步骤。

2.需要铺板的细胞长满时数量较多，因此计数时稀释倍数尽量大，取混悬液的每一步保证细胞充分混匀，计数结果更为准确。

3.镜下计数细胞时，最少计数两次，取平均值为最终结果。

4.细胞混悬液加入细胞计数板时，建议使用10μl小枪头、2-20μl移液器，枪头倾斜抵住盖玻片边缘，缓慢加入，务必保证细胞混悬液全部加入，计数区充盈。

关于细胞计数，以如下实例来充分理解上述计算过程：

1.假设实验要求最后铺板密度为1×105个/ml，计划以6孔板铺板，拟使用4个孔，每孔2ml培养基，则所需细胞总数为：1×105×2ml×5孔=1×106个。

2.假设4孔细胞总数为100个，则细胞密度为：100/4×104×50（稀释倍数）=1.25×107个/ml。

3.最终所需细胞悬液量为：1×106/1.25×107=0.08ml=80μl

4.铺板：培养基5孔（为防止不够所以多准备1孔）2ml×5孔=10ml加入细胞混悬液800μl，混匀加入六孔板即可。