摘  要 

肿瘤治疗性mRNA疫苗作为一种新型肿瘤治疗方式受到广泛关注，目前多数产品正处于临床前或临床研究阶段，国内外尚无成熟的产品上市。由于肿瘤治疗性mRNA疫苗的靶点特性、作用机制、递送特征，以及人体与动物免疫系统存在的差异，使得此类产品在非临床试验设计和评价中情况更复杂。其中动物模型的选择不仅是非临床有效性关注的内容，也是毒性评价的关键考虑因素。本文从肿瘤治疗性mRNA疫苗产品非临床试验设计的角度，根据此类产品自身特点，通过分析、总结已开展临床产品的非临床研究，结合相关指导原则，探讨此类产品非临床评价关注的问题。

2019年新型冠状病毒肺炎暴发以来，全球积极开展疫苗研发工作，mRNA疫苗作为新一代疫苗受到广泛关注。mRNA疫苗是利用抗原编码信使RNA，通过特定的递送系统使细胞摄取并表达编码的抗原，从而引起体液和细胞介导的免疫反应的疫苗。使用mRNA疫苗技术研发新型治疗性肿瘤疫苗，也为肿瘤治疗带来了新的机会。目前已有许多制药企业已经开展了肿瘤疫苗研发管线，部分产品进入Ⅰ期和Ⅱ期临床试验阶段。肿瘤疫苗为肿瘤的治疗带来新的突破，也是继肿瘤化疗、放疗、细胞免疫治疗之后的新型治疗方式。国内外肿瘤治疗性mRNA产品多处于临床前或临床研究阶段。临床进展较快的为Moderna公司的mRNA-4157/V940，由编码多达34种新抗原的单一合成mRNA分子组成，正在开展与程序性死亡受体-1（PD-1）抑制药Keytruda联合治疗黑色素瘤的Ⅱb期临床试验，结果可见一定的临床获益。

肿瘤治疗性mRNA疫苗与预防性mRNA疫苗相比，存在给药间隔缩短、给药频率增加或更长的给药周期等情况，肿瘤治疗性疫苗多为细胞免疫激活特异性T细胞杀伤肿瘤，而预防性疫苗多以体液免疫为主，伴随细胞免疫，免疫反应类型不同。因此对肿瘤治疗性mRNA疫苗在概念验证、组织分布、安全性研究及新辅料的研究与预防性mRNA疫苗存在一定差异。肿瘤治疗性mRNA疫苗产品非临床研究可参考的相关的指导原则有国家药品监督管理局于2021年12月发布的《基因治疗产品非临床研究与评价技术指导原则》，ICH S12《基因治疗产品非临床生物分布考虑》。本文通过分析已开展临床产品的非临床研究，结合相关指导原则，探讨此类产品非临床评价关注的问题。

1、 受试物

非临床研究用受试物应能代表临床拟用样品，原则上应考虑生产工艺流程、关键质量特征及临床拟用制剂等因素。若非临床样品辅料、生产工艺、生产场地等发生变更，应进行质量对比研究，评估工艺变更对本品有效性及安全性的影响，必要时应开展非临床桥接研究，以提供产品的有效性和安全性的支持信息。

2、 有效性

2.1   概念验证研究

对于肿瘤治疗性mRNA概念验证一般包括体外和体内研究。体外应进行抗原表达、特异性T细胞激活或特异性肿瘤细胞杀伤等试验，评估受试物生物学活性及对作用机制的初步验证。体内研究主要为在相关动物模型上验证抗肿瘤活性获得最低起效剂量，伴随检测特异性免疫T细胞表型、细胞因子等免疫相关指标，进一步验证本品有效性及作用机制。体内有效性研究应为临床给药途径、给药频率提供支持性依据，为临床起始剂量选择提供参考。

对于一些mRNA产品，啮齿类动物（大鼠、小鼠）和非人灵长类动物可能为非相关动物种属，因此在开展非临床研究时可能采用动物源基因样品进行试验。替代产品应有与临床拟用样品相似的目的抗原表达、抗原递呈、免疫系统特异性激活等作用。如：在目标靶细胞中考查人源与鼠源产品的细胞转染率及抗原表达量；动物体内试验考查动物源产品激活T细胞的能力。对于编码个性化肿瘤新生抗原的mRNA疫苗，如果无相关动物种属，替代产品可选择动物源肿瘤相关的抗原进行编码。对于采用动物源替代产品开展体内有效性研究仅能在一定程度上评价递送系统的递送效果，不能提示抗原序列的抗肿瘤有效性特征。对于无相关动物种属而选用替代产品开展体内有效性研究的产品，其体外功能活性及抗肿瘤作用是提示产品有效性的关键信息。

基于肿瘤适应证复杂的免疫抑制机制，联合治疗是克服这一问题的关键，常见的联合策略有放化疗与免疫治疗联合、靶向治疗与免疫治疗联合等。对于mRNA治疗性疫苗，如拟开展联合给药临床试验，建议应先在非临床中验证联合用药带来的获益与风险，为临床联合用药提供合理性依据。

2.2 动物种属/模型

选择相关的动物种属/模型是开展体内有效性试验的前提。相关动物种属选择应考虑动物对表达抗原的免疫原性、药理作用等，如受试物在动物体内表达的抗原不能引起特异性免疫反应，则可能不是相关动物种属。肿瘤动物模型选择，应根据拟申请适应证（血液瘤或实体瘤）、目的抗原表达情况建立合适的荷瘤模型，可以是鼠源肿瘤模型或人源化小鼠荷瘤（人源肿瘤）模型。如对于编码免疫刺激的产品，可以建立免疫系统人源化小鼠异种移植瘤模型，考查其在体内刺激免疫系统发挥抗肿瘤作用机制。

3、 药代动力学

mRNA产品通常需开展体内分布试验，应采用合适的动物种属或模型，选择临床拟用给药途径，给予足够的剂量开展，通常采用荧光定量聚合酶链反应（qPCR）方法考查其在体内靶组织及非靶组织的分布和清除，可选择在肿瘤模型动物中开展分布研究。组织分布取样时间点应能说明药物在体内的复制特征，至少包括峰值和清除阶段。替代产品的生物分布试验可能不足以反映临床用样品的生物分布特征，一般建议在合适的动物模型中进行临床样品生物分布研究。

4、 安全性

一般毒理学试验用于评估药物毒性特征、毒性反应可逆性、延迟毒性及剂量-毒性关系等，是新药申请临床试验的关键安全性试验，包括单次给药毒性试验和重复给药毒性试验。一般毒理学试验设计应关注动物种属选择、剂量设置、给药周期、给药频率、动物数量、对照选择等问题。动物种属一般选择健康动物，但在无相关动物种属时，可选择肿瘤模型动物开展毒理研究，如人免疫系统重建荷人源肿瘤模型等。根据产品特点在至少一种动物种属中开展毒理试验。重复给药毒性试验应获得剂量-毒性反应关系，选择合适的给药途径、给药频率及周期为临床试验方案提供支持性依据。安全性研究除常规指标考察外，还应关注免疫反应引起的安全性担忧，对含脂质纳米粒（LNP）等递送系统的产品应关注与递送系统相关的毒性。

对于无相关动物种属的产品，且人源化重建动物模型因模型原因死亡较多无法评价等情况，可考虑使用替代产品。替代产品的毒理学试验在反映产品安全性信息方面具有局限性，在于其可能与临床拟用样品存在质量属性、组织分布、作用机制等差异，不能全面提示临床安全性风险及不能支持临床起始剂量拟定，仅作为安全性评价的参考。

安全药理学是评价产品对生理功能的潜在不良影响，一般包括心血管、呼吸和中枢神经系统。一般来说，对于mRNA疫苗类产品安全药理学试验可单独开展，也可结合在一般毒性试验中考查。如结合在一般毒性试验中，应关注数据采集时间及检测指标。免疫原性、免疫毒性、局部刺激性等安全性试验也可结合重复给药毒性试验进行考察。

肿瘤治疗性mRNA疫苗生殖毒性、致癌性试验可参考ICH S6《生物制品的临床前安全性评价》、ICH S9《抗肿瘤药物非临床评价》等指导原则的相关建议。对于无法采用正常动物开展生殖毒性研究的产品，可根据其作用特点、一般毒理发现、生物分布等信息综合评估生殖毒性风险。

5、 新辅料

LNP是目前常用的递送系统，制备LNP的脂质成分、缓冲体系及相关成分可能影响颗粒整体质量特性及有效性、安全性。因此，对于使用新脂质成分或工艺重大变更的LNP，需对LNP进行非临床安全性研究。如含新阳离子脂质的LNP，应对其新阳离子脂质成分或LNP进行遗传毒性研究，对LNP可伴随疫苗或单独开展必要的安全药理及一般毒理试验。

6、 讨论

肿瘤治疗性mRNA疫苗作为一种新的肿瘤治疗手段，虽然临床试验正在积极开展，但总体仍处于开发初期。对于此类产品的非临床试验方法、试验设计也处于不断探索的阶段，非临床设计整体考虑也与其表达抗原、递送载体等特性密切相关。

肿瘤治疗性疫苗根据编码产物可分为mRNA编码免疫刺激剂、肿瘤相关抗原(TAA)、新抗原3种。①免疫刺激剂主要通过受体介导发送的信号调节免疫反应的质量，可作为mRNA疫苗的编码抗原增强机体的抗肿瘤免疫，常与其他免疫治疗药物共同使用，可编码细胞因子包括白细胞介素-2（IL-2）、IL-23、IL-12、IL-15等。②mRNA编码TAA是目前最常用的靶向抗原，将TAA作为抗原进行编码，从而达到对肿瘤细胞的靶向识别与杀伤效果。然而，其局限性在于TAA在正常组织细胞中也有表达，可能会引发免疫耐受或脱靶效应；且TAA具有变异性，易发生免疫逃逸和耐药。③mRNA编码新抗原作为个性化治疗。新抗原（neoantigen）广义上是指由肿瘤细胞的突变基因所编码产生的，能被机体免疫细胞所识别，并激活免疫应答的一类异常表达的蛋白质。新抗原疫苗是由非沉默体细胞突变产生的具有肿瘤特异性表达的 T 细胞表位，具有高免疫原性、个体化特性，在正常组织中不表达。接种新抗原疫苗既可以扩大已有的新抗原特异性 T 细胞群，又可以在癌症患者中诱导更广泛的新特异性T细胞，从而发挥抗肿瘤效应 。

mRNA带有负电荷，在体内递送需要穿越双层脂膜跨膜负电位的屏障；在细胞质内，外源mRNA也存在着被核糖核酸酶降解的风险。mRNA肿瘤疫苗的传统递送方式包括病毒载体、体外负载DC等，而目前使用更广泛的为纳米脂质材料载体。DC作为最强大的抗原提呈细胞，除诱导CD4+ T细胞免疫应答以外，可将外源性抗原经MHC-Ⅰ途径交叉提呈，诱导CD8+ T细胞的免疫应答。不足之处在于制备过程相对复杂，且易受到肿瘤异质性和肿瘤抗原靶标选择的影响。LNP是目前转染效率较高的递送系统，LNP 脂质壳结构主要由胆固醇、中性磷脂、聚乙二醇 (PEG)-脂质和可电离阳离子脂质组成，胆固醇稳定 LNP中性磷脂支持脂质双层结构并有助于溶酶体逃逸，PEG-脂质能延长疫苗的半衰期防止颗粒聚集，可电离脂质在酸性条件下带正电，通过静电作用吸附负电性的 mRNA 形成复合物，是 mRNA 递送和转染效率的决定性因素。

药物的非临床评价对药物的开发、使用具有重要的指导意义。肿瘤治疗性mRNA疫苗作为一种创新性治疗手段，研发中涉及的抗原选择、概念验证、安全性评价、递送系统都需经过充分地研究，才能在肿瘤免疫治疗方面取得突破。本文通过整理对肿瘤治疗性mRNA疫苗非临床评价的一般性问题考虑，梳理审评中常见问题，以期为肿瘤治疗性mRNA疫苗的研发提供参考。