一、 实验原理

BCA是一种碱性的水溶性复合物，性质稳定。在其提供的碱性环境下，蛋白质可以将BCA试剂中的Cu2+还原为Cu+，Cu+继而与BCA试剂螯合，从而产生蓝紫色的络合物，在562nm波长处具有强吸收峰，通过测定吸光度，结合标准曲线即可得知蛋白浓度。BCA法因抗干扰性强、简便准确，灵敏度高而得到广泛应用，但其也易受温度、孵育时间的影响。

二、 实验步骤（视试剂盒而定）

1) 蛋白标准品配制

室温完全溶解蛋白标准品,取20µl 5mg/ml BSA蛋白标准溶液用PBS溶液稀释至100µl,使其终浓度为1.0 mg/ml。

2) 配制BSA标准测定溶液

3) 工作液配制

将A液与B液按照50:1的比例混合，配成BCA工作液，并混匀。注：此处一定要精准计算待测孔所用工作液的量，如测定4个蛋白样本，均做3个复孔，那么加上标曲一共有39孔，每个测定孔均需加入200µl的工作液，那么共需7800µl工作液，则A液：B液=7800:156。

4) 加样

按照第二步所示表格加标准曲线测定孔，将待测样本以适当体积加入并用PBS补足至20ul（待测样本加入的量可按照经验值进行估计）。

5) 孵育

向各孔中加入200µl的工作液，混匀后37℃孵育30min，亦可室温放置2h。

6) 测吸光度

测定562nm处的吸光度，记录数值，代入标曲计算浓度。

7) 绘制标准曲线计算样品浓度

a.新建一个Excel表格，将得到的标准品的吸光度按照下方表格排列，并按照试剂说明说输入相应标准品的浓度（这里作者剔除了一个离群值）；

 注：此处进行了一个单位的换算，这个可根据大家的个人习惯来

b.选中标准品的吸光度和浓度，点击“插入”，选择散点图；

c.点击散点图上的任意一点，右键选择添加趋势线

d.点击设置，趋势线选项选择“线性”，勾选“显示公式”和“显示R平方值”，即可得到标准曲线；

        注：横坐标为吸光度，纵坐标为浓度，R2需要大于0.99方可使用

e.计算样本浓度：代入公式直接计算即可，但要记得样本稀释倍数再给还原回去哦。

三、 注意事项

1)标准品可现配现用，也可配制后在-20℃保存一年，但工作液需要现配现用。

2)为保证蛋白浓度测量的准确性，最好做3个复孔，必要时剔除离群值。

3)BCA法测蛋白浓度易受时间及温度的影响，所以最好每次测定都做标准曲线。

4)在制作标曲时，一定要分清横纵坐标哪个代表浓度哪个代表吸光度，不要搞错。

5)加样时一定要准确加样且尽可能避免气泡产生，以免影响测量（加样结束可以用注射器戳破气泡，并将96孔板放在摇床上混匀片刻，以使样品与工作液充分接触）。

6)孵育结束应尽快检测吸光度，并尽可能加快检测速度，以免带来误差。

7)一般情况下，样品的蛋白浓度是比较高的，需要用PBS溶液进行稀释后测量，稀释倍数可根据经验值进行调整，保证浓度测量在标准曲线范围内进行。