摘 要： 建立高效液相色谱法测定舒美宁胶囊中的4种大豆异黄酮成分，并综合评价不同厂家、不同批号舒美宁胶囊的质量。舒美宁胶囊样品经Thermo Hypersil-Keystone C18色谱柱分离，以乙腈-水溶液为流动相梯度洗脱，柱温为40 ℃，检测波长为254 nm。通过化学计量学、熵权优劣解距离法对其大豆异黄酮成分差异性进行研究。大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的质量浓度分别在各自的线性范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999 5。样品平均回收率为97.57%~98.15%，测定结果的相对标准偏差为0.88%~1.47%（n=6）。化学计量学研究表明15批舒美宁胶囊聚类为3类，大豆苷、染料木苷是影响舒美宁胶囊质量的特征性成分。该方法可用于舒美宁胶囊的质量评价，并为其内在质量的有效控制提供了参考依据。

关键词： 舒美宁胶囊； 高效液相色谱法； 化学计量学； 熵权优劣解距离法； 质量评价

 

舒美宁胶囊是一款以大豆异黄酮为主要成分的保健品，大豆异黄酮的分子结构与人体雌激素结构极为相似，它能够调节生物体内分泌和代谢紊乱等问题，因此舒美宁胶囊特别适宜睡眠不佳的成年女性改善睡眠[1-3]。

目前舒美宁胶囊的含量检测报道较少[4]，测定大豆异黄酮含量的报道较多，检测方法主要包括薄层扫描法[5-6]、紫外分光光度法[7-8]、高效液相色谱法[9-12]、超高效液相色谱法[13-14]等。其中，薄层扫描法具有操作简便、快速且成本低的优点，但其精密度和准确性相对较低；紫外分光光度法虽然设备简单、操作方便且灵敏度高，但其准确性仍有待提高；超高效液相色谱法尽管分析效率高，但成本较高，且设备普及率不如高效液相色谱法。相比之下，高效液相色谱法以其高分离性能、快速分析、定量准确、操作简便及设备普及率高等优势，成为大豆异黄酮定量分析中最广泛应用的方法。

化学计量学是数学、统计学、计算机科学与化学结合而形成的化学分支学科，它能科学处理和解析数据并从中提取有用信息，更全面地评价产品品质。借助化学计量学中的层次聚类分析(HCA)、主成分分析(PCA)、正交偏小二乘法-判别分析(OPLS-DA)等方法[15-18]，可以对多批次样品间各评价指标数据差异进行分析，查找对产品品质起决定性作用的主要潜在质量标志物。化学计量学因结果准确度高而广泛应用于评价中药材、中成药等成分复杂物质的质量。熵权优劣解距离[19](EW-TOPSIS)法通过对各评价指标的相关数据进行归一化处理、加权决策矩阵分析，计算最优、最劣距离以及各评价指标与最优方案的接近程度，反映各评价指标间的差距，从而对样品的品质差异进行科学评价，具有较好的准确性和科学性。高效液相色谱多成分定量联合化学计量学和熵权优劣解距离法评价舒美宁胶囊质量的方法，尚未见报道。

笔者采用高效液相色谱法对舒美宁胶囊多种大豆异黄酮进行定量测定，并结合化学计量学及熵权优劣解距离法对舒美宁胶囊进行质量评价，不仅有助于舒美宁胶囊生产企业查找原因，完善产品质量控制方法，还将控制全面、评价合理的多成分质量控制方法引入保健品的质量评价中，为提高我国保健品质量提供了新的思路和参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters2695型，配置Waters 2996-二极管阵列检测器，美国沃特世公司。

电子天平：(1)AB-104N型，感量为0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多有限公司；(2)AUW-220D型，感量为0.01 mg，日本岛津仪器有限公司。

4种大豆异黄酮标准物质信息见表1。

表1   4种大豆异黄酮标准物质信息

Tab. 1   Information of 4 Soy isoflavones reference materials

乙腈：色谱纯，纯度(质量分数)不小于99.5%，北京迪科马科技有限公司。

乙醇：分析纯，纯度(质量分数)不小于98.3%，天津市津东天正精细化学试剂厂。

舒美宁胶囊：本草天工牌舒美宁胶囊、知御堂中天骏康牌舒美宁胶囊、北京同仁堂舒美宁胶囊(样品代号为S1～S15)。

实验用水为滤过超级纯净水。

1.2 色谱条件

色谱柱：Thermo Hypersil-Keystone C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国赛默飞世尔科技公司)；柱温：40 ℃；检测波长：254 nm；进样体积：10 μL；流动相：A相为乙腈，B相为水，洗脱方式：梯度洗脱，流量为1.0 mL/min：洗脱程序见表2。

表2   梯度洗脱程序

Tab. 2   Gradient elution procedure

1.3 溶液制备

混合对照品溶液：取减压干燥至恒重的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素对照品适量，精密称定，将4种对照品分别置于10 mL容量瓶中，加入50%乙醇溶解并稀释至标线，摇匀，作为对照品储备液。量取4种对照品储备液适量，精密量取，置同一50 mL容量瓶中，加入50%乙醇稀释至标线，摇匀，即得混合对照品溶液。混合对照品溶液中，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的质量浓度分别为42.8、40.3、38.5、45.8 μg/mL。

样品溶液：取舒美宁胶囊内容物0.1 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中。加入50%乙醇约40 mL，超声处理30 min，放冷至室温。再加入50%乙醇定容至标线，摇匀后取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过。

阴性样品溶液：按舒美宁胶囊处方比例和生产工艺制备阴性样品，按样品溶液的方法制备。

系列混合标准工作溶液：分别精密吸取混合对照品溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL，用50%乙醇溶解稀释至10 mL，制成6种不同浓度的系列混合标准工作溶液。

1.4 实验方法

建立HPLC法测定舒美宁胶囊多个大豆异黄酮的分析图谱，利用标准曲线外标法进行定量分析，再运用化学计量学中的HCA、PCA、OPLS-DA以及EW-TOPSIS等方法对多批次舒美宁胶囊大豆异黄酮含量差异性进行分析。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 样品制备方法优化

2.1.1 提取溶剂考察

为选择对测定的大豆异黄酮均有良好溶解能力的溶剂，考察了一系列不同比例的乙醇水溶液的提取效率。不同比例的乙醇水溶液对4种大豆异黄酮的提取效率如图1所示。

图1   不同提取溶剂提取效率图

Fig. 1   Extraction efficiency chart of different extraction solvents

从图1中可以看出，50%乙醇溶液对4种大豆异黄酮成分均有良好的提取效率，进一步增加或减少乙醇比例也不能提高提取效率。因此选择50%乙醇溶液作为舒美宁胶囊的提取溶剂。

2.1.2 提取方式的选择

大豆异黄酮的提取方式多样，如溶剂浸提法、超声波提取法、超临界流体萃取法等，溶剂浸提法能有效进入大豆的细胞壁提取大豆异黄酮，但试剂消耗量大、提取时间长、提取效率低，超临界流体萃取法由于设备要求较高、耗能大、成本昂贵，不适宜推广使用，超声波提取法与前两者相比，不仅减少了有机试剂消耗量，同时还降低提取时间，提高了提取效率，提取时间10 min即可以获得较高提取效率。从舒美宁胶囊的制备工艺可知，主要原料均已磨成粉末，其细胞壁已破坏，因此采用超声提取，即可提取大豆异黄酮，故选择超声波提取为舒美宁胶囊的提取方法。

2.1.3 超声时间考察

用舒美宁胶囊制备样品溶液，比较超声15、30、45、60 min各成分的提取效率。结果表明，超声30 min已基本能将舒美宁胶囊中的大豆异黄酮有效提取，因此超声时间选择30 min。

2.2 方法专属性

分别精密吸取混合对照品溶液、样品溶液及阴性样品溶液，在1.2仪器工作条件下进样测定，色谱图如图2所示。从图2中可以看出，舒美宁胶囊样品中各成分与对照品在相应的保留时间处具有相同的色谱峰，且阴性样品无干扰，表明该方法专属性良好。

 

图2   混合对照溶液、样品溶液、阴性样品溶液色谱图

Fig. 2   Chromatograms of mixed standard solution， sample solution， and negative control solution

1—大豆苷；2—染料木苷；3—大豆苷元；4—染料木素

 

2.3 线性关系、检出限及定量限

取系列混合标准工作溶液，在1.2色谱条件下进样检测，并记录色谱图。以色谱峰面积为纵坐标(y)，以混合对照品溶液的质量浓度为横坐标(x)，绘制标准曲线，计算线性方程。分别将系列混合标准工作溶液注入色谱仪进行检测，以信噪比为3对应的质量浓度作为检出限，信噪比为10对应的质量浓度作为定量限。4种大豆异黄酮成分的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表3。由表3可知，大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素的质量浓度分别在各自的线性范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.999 5。

表3   质量浓度线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 3   Linear equations, linear ranges, and correlation coefficient values for each component

2.4 加标回收与精密度试验

取同一批次舒美宁胶囊内容物6份，每份约0.1 g，精密称定，置于50 mL容量瓶中，按样品中4种大豆异黄酮含量的1∶1比例加入4种大豆异黄酮对照品溶液，再加入50%乙醇定容至标线，超声处理30 min，放冷至室温。再加入50%乙醇定容至标线，摇匀后取上清液，用0.45 μm的微孔滤膜滤过。在1.2色谱条件下进样测定，加标回收率试验结果见表4。

表4   加标回收与精密度试验结果

Tab. 4   Results of standard addition recoveries and precision test

由表4可知，样品的平均回收率为97.57%～98.15%，测定结果的相对标准偏差为0.88%～1.47%（n=6），表明该方法准确度较高。

2.5 含量测定

取15批舒美宁胶囊，制备供试品溶液，在色谱仪中进样测定，按照外标法计算大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量，舒美宁胶囊各成分含量结果见表5。

表5   舒美宁胶囊各成分含量

Tab. 5   The content of each component in Shumeining capsules

 

2.6 化学计量学的评价方法建立

2.6.1 层次聚类分析(HCA)

运用SPSS26.0统计软件对15批样品的4种大豆异黄酮含量数据进行层次聚类分析，并得到了相应的层次聚类分析图，如图3所示。通过层次聚类分析的结果，当选择欧氏间距等于10作为分类标准时，15批舒美宁胶囊样品可以清晰地划分为三个类别，第1类是S10、S11、S1、S2、S3、S9，第2类是S13、S14、S15、S12，第3类是S4、S5、S6、S7、S8，这表明不同厂家生产的舒美宁胶囊大豆异黄酮的含量呈现一定的差异。

图3   层次聚类分析图

Fig. 3   Hierarchical clustering analysis chart

2.6.2 主成分分析(PCA)

将15批样品的4种大豆异黄酮含量数据导入SPSS26.0统计软件，舒美宁胶囊主成分方差分析结果见表6。

表6   舒美宁胶囊主成分方差分析结果

Tab. 6   Principal component analysis of variance results of shumeining capsules

由表6可知，舒美宁胶囊检测结果中两个初始特征值分别为1.895、1.042，均大于1.0，它们的方差百分比分别为47.37%、26.06%，累积方差比为73.43%，两者合起来能体现舒美宁胶囊中大豆异黄酮73.43%的显示表征。利用SIMCA14.1建立PCA模型，运用PCA模型得到了15批舒美宁胶囊样品的主成分分析得分图，如图4所示。

图4   舒美宁胶囊的主成分分析图

Fig. 4   Principal component analysis of shumeining capsules

该模型提取了2个主成分，R2X为0.735,，大于0.5，表明建立的PCA模型具有较高的稳定性。

2.6.3 正交偏小二乘法-判别分析(OPLS-DA)

为查明对产品质量影响较大的大豆异黄酮成分，将15批样品的4种大豆异黄酮含量数据导入SIMCA14.1软件，利用OPLS-DA分析进行处理，舒美宁胶囊的OPLS-DA模型图如图5所示。从图5中可以看出，区分参数R2Y为0.842，预测参数Q2为0.770，这些数值均表明所建立的模型是高效且稳定的[18]。

图5   舒美宁胶囊的OPLS-DA模型图

Fig. 5   OPLS-DA model diagram of Shumeining capsules

对所建立的OPLS-DA模型中2个主成分进行交叉验证(n=200)，OPLS-DA置换检测结果如图6所示。从图6中可以看出，R2 拟合直线在Y轴截距为0.098，小于0.3，表明所建立的模型结果可靠。Q2拟合直线与Y轴交点为-0.563，小于0，表明所构建的OPLS-DA模型未过度拟合，具备良好的预测能力，可有效判别舒美宁胶囊中大豆异黄酮的质量差异。

图6   OPLS-DA置换检测结果

Fig. 6   OPLS-DA permutation test results

进一步测定样品的VIP值，并采用VIP值来确定不同批次样品间的差异成分，结果如图7所示。结果表明VIP值从大到小依次为染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆苷元，其中染料木苷的VIP值为1.286、大豆苷的VIP值为1.162，均大于1.0，这2个成分对舒美宁胶囊中大豆异黄酮质量差异具有较大影响，在舒美宁胶囊产品质量控制中起着关键作用，可视为主要的潜在质量标志物。

图7   OPLS-DA中各成分VIP图

Fig. 7   VIP plot of each component in OPLS-DA

2.7 熵权优劣解距离法分析(EW-TOPSIS)

舒美宁胶囊中4种大豆异黄酮成分属于最大最优型指标，对15批舒舒美宁胶囊样品中的4种成分数据进行归一化处理，结果见表7，将OPLS-DA分析结果中的VIP值作为各指标成分的权重，并得出加权决策矩阵表，结果见表8。按照加权决策矩阵得出最优方案Z+为1.286，最劣方案Z-均为0；，按照式(1)、式(2)、式(3)计算最优、最劣距离(Di+、Di-)以及各评价指标与最优方案的接近程度(Ci)，结果见表9。15批样品中得分排名前三的依次为S9、S3、S10。

表7   不同样品各成分归一化处理结果

Tab. 7   Normalization results of different samples and components

表8   不同样品各成分加权决策矩阵表

Tab. 8   Weighted decision matrix for different components of samples

 

(1)

 

(2)

 

(3)

式中：Zij——经加权的标准化指标值；

Zj+——各评价指标的正理想解；

Zj-——各评价指标的负理想解；

Di-——各评价因素与负理想解的距离；

Di+——各评价因素与正理想解的距离；

Ci——第i个因素的相近程度。

表9   不同样品质量评价排序表

Tab. 9   Sorting table for quality evaluation of different products

 

 

 

3. 结语

 

建立了高效液相色谱多成分定量联合化学计量学和熵权优劣解距离法评价舒美宁胶囊质量，通过优化色谱条件，采用多成分、化学计量学以及熵权优劣解距离法，选取不同厂家不同批次的舒美宁胶囊进行试验。不同厂家的舒美宁胶囊大豆异黄酮含量存在一定差异，大豆异黄酮中大豆苷、染料木苷是影响舒美宁胶囊的主要成分，该方法专属性强、准确度高，有助于生产企业完善产品质量控制方法，为提高产品质量和稳定产品疗效提供参考。

 

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