各种细菌所具有的酶系统各不相同，对营养物质的利用能力各异，因而在代谢过程中所产生的合成或分解产物也不同。应用生物化学方法检测细菌的代谢产物，有助于细菌的种、属鉴定。这种利用生化方法来鉴别细菌的试验，统称为细菌的生化试验或生化反应，是识别细菌的重要方法之一。微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其他方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

 

微生物检验中常用的生化反应有：

(一)糖酵解试验

各种微生物因含有不同的分解糖(醇、苷)类的酶，所以分解糖类的能力各不相同，而且分解相应糖类后形成的终末产物亦随细菌种类而异，有的产酸，有的还可以产生气体，因此可作为鉴别细菌的依据，对肠道杆菌的鉴别尤为常见。可用指示剂及发酵管检验。

试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接种于发酵液体培养基鲁，若为半固体培养基，则用接种针作穿刺接种。接种后，置36℃ ±1.0 ℃培养，每天观察结果，检视培养基颜色有无改变（产酸），小倒管中有无气泡，微小气泡亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力，若有动力，培养物可呈弥散生长。

 

本试验主要是检查细菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示剂为酚红、溴甲酚紫、溴百里蓝和An-drade指示剂。

 

(二)淀粉水解试验

某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。

 

试验方法：以18h~24h的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接移种于淀粉肉汤中，于36℃ ±1 ℃培养24 h ~48 h,或于20℃培养5d。然后将碘试剂直接滴浸于培养基表面，若为液体培养物，则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤呈深蓝色。

 

淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间、培养基含有淀粉量和pH等均有一定关系。培养基pH必须为中性或微酸性，以pH7. 2最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时制备为妥。

 

(三) V-P试验

某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中的氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称V-P（+）反应。

 

1.O'Meara氏法

将试验菌接种于通用培养基，于36 ℃ ±1 ℃培养48 h,培养液1 mL加O‘Meara试剂（加油0.3%肌酸或肌酸酐的40%氢氧化钠水溶液)1mL，摇动试管1min~2min，静置于室温或36 ℃ ±1 ℃恒温箱，若4h内不呈现伊红即判定为阴性。亦有主张在48 ℃-50 ℃水浴放置2h后判定结果者。

 

2. Barritt氏法

将试验菌接种于通用培养基，于36℃ ±1 ℃培养4 d,取培养液2.5 mL先加入5% α-萘酚纯酒精溶液0.6%mL，再加40%氢氧化钾水溶液0.2mL，摇动2min~5min，阳性菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36 ℃ ±1 ℃恒温箱，如2h内仍不显现红色可判定为阴性。

 

3.快速法

将0.5%肌酸溶液2滴放于小试管中，挑取产酸反应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加入5% a-萘酚3滴， 40%氢氧化钠水溶液2滴，振动后放置5 min,判定结果。不产酸的培养物不能使用。

 

本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽孢杆菌和葡萄球菌等其他细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基甲醇的产生，故应省去或以氯化钠代替。本试验常与甲基红试验一起使用。本试验阳性，甲基红试验阴性，反之亦然。

 

(四) 甲基红试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸、琥珀酸、乙酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基pH 下降至4.5以下，使甲基红指示剂变红。

 

试验方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培养于36 ℃ ±1 ℃或30℃ (以30℃较好) 3d-5d,从第二天起，每日取培养液1 mL,加甲基红指示剂1~2滴，阳性呈鲜红色，弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性即可判定结果。

 

甲基红为酸性指示剂， pH范围为4.4-6.0,其pH为5.0,故在pH5.0以下，随酸度增加而红色增强，在pH5.0以上，则随碱度增加而黄色增强，在pH5.0或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间，重复试验。

 

(五)靛基质试验

某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为红色化合物。

 

试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36℃ ±1 ℃培养24 h后，取约2 mL培养液，加入Kovacs氏试剂2滴~3滴，轻摇试管，呈红色为阳性；或先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入Kovacs氏试剂数滴，在接触面呈红色，即为阳性。

 

实验证明靛基质试剂可与17种不同的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或5-甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。

 

(六)硝酸盐还原试验

有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的存在可用硝酸试剂检验。

 

1.试验方法

临试前将试剂的A (磺胺酸冰乙酸溶液)和B (a-萘胺乙醇溶液)试液各0.2 mL等量混合，取混合试剂约0.1 mL,加于液体培养物或琼脂斜面培养物表面，立即或于10 min内呈现红色即为试验阳性，若无红色出现则为阴性。

 

用a-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快，故加入后应立即判定结果。进行试验时必须有未接种的培养基管作为阴性对照。a-萘胺具有致癌性，故使用时应加注意。

 

2.试验方法

将含有0.02%-0.2%硝酸钾的蛋白胨水分装至试管中，每支试管预先放一个倒置的发酵管，然后在121℃高压灭菌15 min.按肉汤培养基方法接种，连同已灭菌的对照管一起在最佳生长温度培养2d-7d,在接种管和对照管中加上Griess Ilosvay试剂1 mL或亚硝酸盐试纸，几分钟内出现红色表明亚硝酸盐产生。对照管应为微红色或无色。

 

阴性结果应进行确证。向试管中加入微量锌粉，将残存的硝酸盐还原成亚硝酸盐，出现红色表明有硝酸盐存在；如没有颜色变化，则说明没有硝酸盐存在，硝酸盐已被微生物还原成亚硝酸盐。发酵管中有气体产生表明有氮气生成。

 

(七)明胶液化试验

有些细菌具有明胶酶(亦称类蛋白水解酶),能将明胶先水解为多肽，又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。

 

1.营养明胶培养基

在营养肉汤中加入10% ~15%的明胶，调节pH至7.2, 115℃高压灭菌20 min。

 

试验方法：挑取18 h-24 h待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶高层约2/3深度或点种于平板培养基。于20℃-22 ℃培养7 d~14d,明胶高层亦可培养于36 ℃ ±1 ℃。每天观察结果，若因培养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其凝固后，再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴加试剂，若为阳性， 10 min -20 min后，菌落周围应出现清晰带环，否则为

阴性。

 

2. Frazier明胶琼脂(改良型)培养基

在营养琼脂中加入0.4%明胶，调节pH至7.2, 115 ℃高压灭菌20 min。

 

试验方法：在已倒好干燥培养基的平皿上划线接种或点接种。在最佳生长温度下培养2d-14d。使用8mL~10 mL1%盐酸(HCI不像氯化汞溶液那样能很快的产生清晰的沉淀，但本书仍建议使用盐酸，这是为了避免汞盐的毒性及对环境造成的危害)试剂充满培养皿，没有水解的明胶与试剂慢慢形成不透明的白色沉淀，水解的明胶部分呈现了一个清晰的环带。以毫米为单位记录从菌落边缘到环带边缘的清晰带的大小。

 

(八)尿素酶试验

有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解，产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.00。

 

试验方法：挑取18 h-24 h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇匀，于36℃±1℃培养10 min,、60 min和120 min,分别观察结果；或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到到达底部，留底部作变色对照。培养2 h、4h和24 h分别观察结果，变为粉红色为阳性，如阴性应继续培养至4d,做最终判定。

 

(九)氧化酶试验

氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化，然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。这个试验最适用于假单胞菌属和其他革兰氏阴性杆菌的鉴别。

 

试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1滴~2滴，阳性者Ko-vacs氏试剂呈粉红色-深紫色， Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内为判定试验结果。

 

(十)硫化氢试验

有些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。在肠杆菌科的细菌鉴别中有重要作用。

 

试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁穿刺接种，于36℃ ±1℃培养24 h-28 h,培养基呈黑色为阳性。阴性应继续培养至6d。也可用乙酸铅纸条法：将待试菌接种于一般营养肉汤，再将乙酸铅纸条悬挂于培养基上空，以不会被溅湿为适度，用管塞住置36 ℃ ±1 ℃培养为1d-6d,纸条变黑为阳性。

 

(十一)三糖铁(TSI )琼脂试验

试验方法：以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36℃ ±1 ℃培养18 h-24 h,观察结果。

 

本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气(变黄),产生硫化氢(变黑)。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。

 

注意： TSI琼脂培养基可以代替Kligler铁琼脂检测硫化氢的产生。但是，柠檬酸杆菌和变形杆菌属中的一些产硫化氢的菌株，在TSI琼脂培养基中产生的硫化氢会被蔗糖发酵产物所掩盖，因此，在做这些菌的产硫化氢试验时， Kligler铁琼脂是更为可靠的试验培养基。

 

(十二)硫化氢-靛基质一动力琼脂试验

试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约二分之一深度，置36 ℃ ±1℃培养18h-24 h,观察结果。培养物呈现黑色为硫化氢阳性，混浊或沿穿刺线向外生长为有动力，然后加Kovacs氏试剂数滴于培养表面，静置10 min,若试剂呈红色为靛基质阳性。培养基未接种的下部，可作为对照。

 

本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选功效。

 

(十三)柠檬酸盐利用试验

以柠檬酸钠为唯一碳源、pH 7.0的培养基上，某些细菌能分解柠檬酸钠产生碳酸盐，使培养基由中性变为碱性，培养基中指示剂溴麝香草酚蓝由浅绿色变为深蓝色，此为柠檬酸盐利用试验阳性。如不能利用柠檬酸盐，此试验为阴性反应。将细菌分别接种于柠檬酸盐培养基斜面上，于37℃培养1d-4d,每日观察结果。培养基斜面上有细菌生长，而且培养基变成蓝色为阳性；无细菌生长，培养基颜色不变保持绿色为阴性。

 

(十四)邻硝基苯-8-D吡喃半乳糖苷酶测定

乳糖发酵过程中需要乳糖通透酶和B-半乳糖苷酶才能快速分解。有些细菌只有半乳糖苷酶，因而只能迟缓发酵乳糖，所有乳糖快速发酵和迟缓发酵的细菌均可快速水解邻硝基酚-B-D-半乳糖苷(0-nitophenyl-β-D-galactopyranoside, ONPG)而生成黄色的邻硝基酚。用于柠檬酸菌属、亚利桑那菌属与沙门菌属的鉴别。

 

将0.6 g ONPG溶解于100 mL,磷酸缓冲液内，过滤灭菌后，与300 ml.蛋白胨水混合，无菌分装小试管，于冰箱内保存，备用， 1年内使用有效。挑取幼龄斜面培养物一环于上述培养基内，适温培养24 h;制备浓的菌悬液(于0.5 mL生理盐水的细管)中加ONPG纸片，35 ℃-37 ℃培养24 h后，观察结果。黄色为阳性，无色为阴性。也可直接将培养物接种ONPG试剂， 35℃-37 ℃培养1 h-3h即可以观察结果，如为阴性继续培养至24h,培养基变黄则为阳性。

 

(十五)胆汁-七叶苷水解试验

在10% ~40%胆汁存在下，测定细菌水解七叶苷的能力。七叶苷被细菌分解生成七叶素，七叶素与培养基中的柠檬酸铁的二价铁离子发生反应形成黑色化合物。主要用于鉴况D群链球菌与其他链球菌的区别，以及肠杆菌科的某些种、某些厌氧菌(如：脆弱拟杆菌等)的初步鉴别。D群链球菌本试验为阳性。

 

将被检菌接种于胆汁-七叶苷培养基中， 35℃孵育18h~24 h后，观察结果。培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。

 

(十六)苯丙氨酸脱氨酶试验

苯丙氨酸脱氨酶试验可用于鉴别肠道细菌，例如对大肠杆菌与变形杆菌的鉴别。变形杆菌具有苯丙氨酸脱氨酶，能将苯丙氨酸氧化脱氨，产生苯丙酮酸；而大肠杆菌不具有苯丙酸脱氨酶，不能将苯丙氨酸氧化脱氨，故不能产生苯丙酮酸。

 

具体操作为：将大肠杆菌和普通变形杆菌分别接种到苯丙氨酸斜面培养基上(注意接种量要大),置于37℃恒温箱中，培养4h (或18 h-24 h).观察结果时，在培养好的菌种斜面上滴加2滴-3滴10%一氯化铁溶液，试液自培养物上方流到下方，苯丙酮酸遇三氯化铁形成绿色化合物，此为阳性反应；若培养基不出现颜色变化，则为阴性反应。

 

(十七)色氧酸脱氨酶试验

此法可同时测定色氨酸脱羧酶、脲酶和吲哚3个项目。

1.方法一

(1)培养基

L-色氢酸    3g；  NaCl    5g；

KH2PO4  1g;   乙醇(95% ) 10 mL:

K2 HPO4   1g;    蒸馏水   900 mL

 

加酚红(25 mg~30 mg)至微橙的黄色， pH约为6.8~6.9,分装于三角瓶中， 121 ℃蒸气灭菌20 min。另将20g尿素溶于100 mL水中，过滤灭菌，用无菌操作与上述热灭菌的培养基相混，并分装于无菌试管内，每管液层高约3cm ~4 cm。

 

(2)接种与测定：将试验菌株的幼龄培养物接种于上述培养液中，适温培养24 h,取2滴~4滴培养液，与1滴三氯化铁溶液(约33% )相混。如呈红褐色，则为色氨酸脱氨酶阳性反应。如无颜色变化则为阴性反应。可用变形菌作为阳性对照。

 

(3)结果观察：如培养后的培养液由黄色转红色，表示有脲酶存在。如用对甲基氨基苯甲醛试剂测定，可检查有无吲哚形成。如不拟测定脲酶，配制培养基时可不加酚红和尿素。

 

2.方法二

(1)试液

L-色氨酸           0.2% -0.5%

FeCl3              33%

生理盐水或pH6. 8缓冲液

A液： KH2PO4, 0.2 mol/L (27. 2 g/L)  50 mL

B液： Na2 CO3, 0. 2 mol/L (8.0 g/L)  23. 6 mL

注： A液与B液相混即为pH6.8的缓冲液。

 

(2)接种与培养：将试验菌接种于肉汁胨斜面，适温培养24 h。

 

(3)测定方法：取干净的试管2支，每管中加4滴L-色氨酸溶液和4滴生理盐水(或4滴pH6. 8缓冲液),然后将测定菌的菌苔混到上述溶液的2支试管中制成浓溶液。另2支试管中不加菌苔作为对照。置室温15 min ~20 min后，每管中加入1滴三氯化铁(33%)溶液，立即呈现红褐色，表示阳性反应，不变色者表示阴性反应。可用变形菌作为阳性对照。

 

（十八)氰化钾试验

原理：氰化钾可以抑制某些细菌的呼吸酶系统。细胞色素、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶和过氧化物酶均以铁卟啉作为辅基，氰化钾能和铁卟淋结合，使这些酶失去活性，使细菌生长受到抑制。

 

培养基：

蛋白胨        10.0g;   

KH2 PO4    0. 225 g 

Na2HPO4   5.64 g  

蒸馏水        1000 mL

NaCl          5.0g。

 

此为基础液。调节pH至7.6, 121℃灭菌15 min,冷却，置冰箱。

 

于冷基础液中加以15 mL. 0. 5%氰化钾溶液(0.5g氰化钾溶于100 ml.冷却的灭菌蒸馏水中),分装于灭菌小试管，每管约1 ml,立即用随有热石蜡的软木寒塞紧，可于冰箱中保存2周。

 

方法：将20 h-24 h肉汤培养物，接种。大环到氰化钾培养基中，立即用软木塞塞紧，置37 ℃培养，连续观察2d,有细菌生长时为阳性反应。大多数沙门氏菌在此培养基中不能生长，即无浑浊现象。

 

注意：氰化钾为剧毒药，宜在通气橱内操作。由于氰化钾有剧毒，接触皮肤的伤口或吸入微量粉末即可中毒死亡。与酸接触分解能放出剧毒的氰化氢气体，与氯酸盐或亚硝酸钠混合能发生爆炸。如果必须要进行氰化钾试验，使用的都为氰化钾的替代品。

 

(十九)鸟氨酸、赖氨酸和精氨酸脱羧酶试验

1.培养基

涣甲酚紫(1.6% )       0.625 mL

甲酚红(0.2% )          2.5ml

蛋白胨                    5g

琼脂(半固体)               3g~6g

D-葡萄糖                 0.5 g

牛肉膏                    5g

蒸馏水                    1000 mL 

维生素B6 (吡哆醛Pyridoxal) 5 mg;

 

将以上成分加热溶解，调pH为6,再加指示剂。将上列基础培养基分为四等份，其中三份分别加入： L-鸟氨酸、L-赖氨酸、L-精氨酸的盐酸盐，使浓度达到1%.如用DL型氨基酸，则浓度达到2%。再调pH到6.0~6.3,未加氨基酸的一份基础培养基作为空白对照。分装小试管，每管3 mL. ~4 ml, 121 ℃灭菌10 min,鸟氨酸的培养基中可能有少量絮状沉淀，但无碍作用。

 

2.接种

用幼龄培养物作为种菌直接接种，接种后封油。对照管与测定管同时接种。

 

3.结果观察

对肠杆菌科的细菌，一般于37 ℃培养4d,每天观察。但对非临床来源的菌可于30℃培养，连续观察7d.指示剂呈紫色或带红色调的紫色者为阳性，呈黄色者为阴性。一般肠杆菌科的细菌于1d-2d呈阳性反应，但也有迟缓阳性者，培养3d-4d才出现阳性反应，对照管应呈黄色。

 

(二十)精氨酸双水解酶试验

1.培养基(索恩利Thornley)

K2HPO4    0.3g;

L-精氧酸盐  10g

蛋白胨        1g

琼脂           6g

NaCl          5g

蒸馏水        1000 mL;

酚红           0.01 g;

L-精氧酸盐  10g

 

pH7.0-7.2,分装试管，培养基高度约4cm ~5 cm, 121 ℃灭菌15 min。

 

2.接种与培养

用幼龄种菌穿刺接种，并用灭菌凡士林油封管，适温培养3d, 7d, 14 d观察。

 

3.结果观察

培养基转为红色者为阳性，应有不含精氨酸空白对照。

 

(二十一)过氧化氢酶试验

过氧化氢酶试验又名接触酶试验，所用试剂为3%过氧化氢溶液(现配现用)。

 

实验方法：挑取固体培养基上菌落一接种环，置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2 mL,观察结果。结果观察：于0.5 min内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

 

(二十二)血浆凝固酶试验

血浆凝固酶常用于金黄色葡萄球菌的检测，当发现可疑菌落时，挑取平板上的可疑菌落1个或以上，分别接种到5 ml脑心浸液肉汤(BHI)和营养琼脂小斜面， 36 ℃ ±1 ℃培养8 h-24 h。

 

取新鲜配置的免血浆(现在有很多厂商生产的方便使用的冻干兔血浆) 0.5 mL,放入小试管中，再加入BHI培养物0.2 ml~0. 3 mL,振荡摇匀，置36 ℃ ±1 ℃温箱或水浴箱内，每0.5 h观察一次，观察6h,如呈现凝固(即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块)或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。使用商品化的试剂时，按说明书进行操作。

 

结果如果可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL, BHI, 36℃ ±1 ℃培养18 h-48 h,重复试验。