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嘉峪检测网 2019-03-01 14:53
Q1: 什么是蛋白质磷酸化？
磷酸化是将磷酸基团加在中间代谢产物上或加在蛋白质上的过程。
Q2: 蛋白质磷酸化的作用？
蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很必要的，包括细胞生长、增殖、泛素介导的蛋白降解等过程。细胞信号转导活动都是由一系列蛋白传递链构成的，信号传导的过程中涉及到多种蛋白质的可逆磷酸化过程。蛋白质通过可逆磷酸化，以及不同的级联反应，可以将信号放大传递等。由此可见蛋白质磷酸化在细胞信号传导过程中担负着重要的作用。
Q3: 检测蛋白质是否磷酸化以及磷酸化水平的常用方法？
Western blot 是评估蛋白磷酸化状态的最常用方法，利用 SDS-PAGE 分离蛋白样品，随后转移到印迹膜上，之后利用磷酸化特异性抗体来鉴定目的蛋白。
有人会说 western blot 还不好做吗？那可是研究生的技能标配，但是磷酸化蛋白的 western blot 就不能小看了，多少人在这里摸爬滚打，绞尽脑汁。下面重点来了，赶紧搬个小板凳认真学起来。
想跑出好的磷酸化蛋白条带，与做普通的 Western Blot 相比，磷酸化 Western Blot 有一些要额外需要注意的事项：
01 检测样本是否表达目的蛋白
实验前需先查阅文献或通过预实验检测该样本是否表达目的磷酸化蛋白，若正常情况下样本的磷酸化水平过低或不表达，可通过物理或化学方法进行一定的刺激和诱导，正确的刺激会帮助得到最佳实验结果。
02 检测总蛋白是否有变化
封检测磷酸化蛋白之外，往往也需要检测总蛋白。仅仅是检测到磷酸化蛋白表达量的升高或降低并不能说明问题，只有磷酸化蛋白与总蛋白比值增加或减少了才能说明磷酸化水平的变化。
03 点样时加入 Marker
做磷酸化蛋白 Western blot 时，除了目标蛋白的条带以外，往往会出现非特异性的条带。如果磷酸化抗体不佳，甚至只有非特异性的条带，而没有目的条带。所以点样时需同时加入合适分子量范围的 Marker，根据 Marker 进行比对，查看条带的分子量，是否是目的条带。否则有可能会误以为一些非特异条带是目的带，白白耗费了大量精力得出错误的结果。
04 抑制磷酸酶的干扰
由于蛋白的磷酸化是可逆的，会被磷酸酶去磷酸化，所以在样品制备和整个检测过程中，需要抑制或避免细胞内源性和外源性的磷酸酶的干扰。针对细胞内源性的磷酸酶，在样品制备时，需要在裂解液中加入足量的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。外源性的磷酸酶主要是由实验过程中的其它试剂带入的，比如要确保实验试剂中不含磷酸酶等；此外，样品中或其它试剂中带的细菌也会分泌外源性的磷酸酶，所以另一个关键是要尽量使用无菌清洁的试剂和凝胶，必要时加入防腐剂。
所谓细节决定成败，除了以上注意事项，操作细节尤其重要，稍不注意就会事倍功半，这就是为什么很多小伙伴在做磷酸化蛋白的 WB 实验时，很疑惑明明按照步骤操作的，为什么结果还是不理想，所以大家一定要注意以下细节。
Tips 1：蛋白提取
1、提取蛋白样品的过程要迅速，样品要新鲜，最好在冰上操作，操作时间尽量短。
2、用 PBS 洗涤细胞时，一定要 4℃ 预冷。如果是组织的话，提取蛋白时采用液氮研磨的方法，研磨器具最好提前预冷，保持低温状态。
3、提取的磷酸化蛋白蛋白定量后马上变性并于 -80℃ 分装保存，以保证降解程度最小，避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。
4、磷酸化蛋白容易脱磷酸化，除提取蛋白时要迅速小心外，也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂 Na3VO4 等。
1、避免印迹封闭时间过长，因为这会掩盖抗原表位，阻止抗体结合。
2、封闭后在 TBST 中洗涤 5 分钟。
3、一抗和二抗均建议用 1*TBST 洗印迹 3 次，每次 5-10min。洗印迹时间不宜过长或过短，过长会导致信号减弱（抗体被洗脱），过短则会导致背景深。洗膜时不要把几张膜叠在一起洗，否则会影响洗膜效果。
1、选择好的磷酸化抗体是成功的关键因素。且尽量根据磷酸化抗体公司的 protocol 来操作实验，这是实验成功的保证。
2、抗体的稀释倍数也要适当，可依据实验结果优化调整。 孵育磷酸化抗体即一抗后建议 4℃ 过夜，保证抗体有充分的结合时间，因为通常磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。
3、二抗孵育室温 1 小时即可。
1、磷酸化蛋白检测时背景往往比较深，所以曝光或压片时间要适当，不能太长或过短，太长则背景太深盖住了目的条带，时间过短则可能没有条带或者条带太浅。可以选择多个时间进行曝光或压片，选择最佳结果，再优化出适合自己目的蛋白和实验体系的最佳条件。
2、一般磷酸化和总蛋白的条带位置基本是一样的，所以可以在显影完磷酸化抗体后，将印迹上已结合的抗体剥离后再孵育总蛋白抗体（需重新封闭）显影。
3、Strip 时一定要注意，印迹膜一定要完全浸泡在含剥离液的容器中，置于 40-50℃ 恒温箱中，使受热均匀，摇床孵育 30 分钟。抗体剥离液是用来去除已结合的抗体，如果温度过高或时间太长但也会去除部分的蛋白，导致蛋白信号变弱。
只要按照以上注意事项操作，小白也会成为实验小达人，做出理想的磷酸化蛋白条带。
来源：博士德
