Western Blot又称蛋白质免疫印迹，其原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的样品进行着色，进而根据着色位置及着色深度判断特定蛋白在组织或细胞中的表达情况。

ImageJ是一款功能强大的开源图像处理和分析软件，常用来分析对实验结果进行定量分析。在wb实验中，ImageJ可以通过蛋白表达的相对强度，进行半定量的分析。以下详细介绍使ImageJ处理wb条带和后续数据分析方法。

1、打开ImageJ，点击File-Open ,选中目的条带。

2、使用ImageJ打开WB图像，并转换为8位灰度图像（Image——Type—— 8-bit）

3、去除背景阴影，Process——Subtract Backfround,在弹出的对话框中Polling ball radius 填50，并勾选Light background,再点击OK。

4、设置测量参数Analyz——Set Measurements，选择所需的统计数据，如面积（Area）、平均灰度值（Mean gray value）、最小和最大灰度值（Min & max gray value）、积分密度（Integrated density）等 。

5、设置单位，Analyze——Set Scale，对话框填写单位pixel。

6、转为亮带，Edit——Invert。

7、根据实际情况用矩形或圆圈选取第一个条带，框内或圈内为整个条带。

8、Analyze——measurement，或者使用快捷键Ctrl+M，即可测量出所选条带的灰度值。同理，可测出所有条带的灰度值，即IntDen所在列数值。

9、根据所测条带的灰度值计算相对表达量，即Target protein与β-actin灰度值的比值。

10、打开GraphPad，选择clumn ，点击create，并将相对表达量录入并命名。 

11、点击Analyze，选择t test，再点击OK。 

12、使用参数非配对t test，如下图所示。 

13、统计结果P<0.05即表示有统计学意义。

14、点击New Graph，根据实际需求选择作图方式。

15、作图并添加统计学差异标识。

常见问题：

1、批量操作时出现错误：确保ImageJ是最新版本，并重启软件。如果问题仍然存在，检查代码中是否有多余的“close”命令，这可能导致活跃图片被关闭。

2、图像尺寸过大：如果图像尺寸超出了ImageJ的最大限制，尝试分块读取图像。

3、图像分析结果不准确：检查阈值设置是否正确，并确保图像质量足够好，以便软件可以正确识别感兴趣的对象。

4、图像无法正确导入：确保图像格式被ImageJ支持，检查文件路径是否正确。

5、图像无法正确保存：检查保存格式是否正确，确保有足够的磁盘空间。

6、图像分析时出现彩色条纹：这可能是由于图像数据类型不正确，转换图像数据类型（Image → Type）。