凝胶色谱法分类

根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。

凝胶过滤色谱：

凝胶过滤色谱一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶的代表是葡萄糖系列，洗脱溶剂主要是水。

凝胶渗透色谱：

凝胶渗透色谱法主要用于有机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)相对分子质量分布分析及分离，常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等有机溶剂。

凝胶色谱不但可以用于分离测定高聚物的相对分子质量和相对分子质量分布，同时根据所用凝胶填料不同，可分离油溶性和水溶性物质，分离相对分子质量的范围从几百万到100以下。

近年来，凝胶色谱也广泛用于分离小分子化合物。化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色谱法达到完全的分离纯化的目的。

凝胶色谱法原理

凝胶色谱法又称体积排阻色谱法，使用水溶液流动相的称为凝胶过滤色谱，使用有机溶剂流动相的称为凝胶渗透色谱。凝胶色谱的固定相是多孔物质，如多孔凝胶、交联聚苯乙烯、多孔玻璃及多孔硅胶等。试样是按照其中各组分分子大小的不同而分离的。大于填料微孔的分子，由于不能进入填料微孔，而直接通过柱子，Z先流出柱外，在色谱图上Z早出现，小于填料微孔的组分分子，可以渗透到微孔中不同的深度，相对分子质量Z小的组分，保留时间Z长。

凝胶色谱与凝胶层析是否一样？

基本上是一致的只是固定相存在差异。凝胶色谱法又称分子排阻色谱法。凝胶色谱主要用于高聚物的相对分子质量分级分析以及相对分子质量分布测试。

凝胶层析又称分子筛过滤、排阻层析，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。

两者的共同点是都不需要有机溶剂。凝胶色谱色谱一般用在HPLC等分析场合。而凝胶层析一般用在制备的时候。

凝胶净化柱和凝胶色谱柱是一回事吗?

原理是一回事，都是排阻色谱。 但是前者是制备柱，对大量样品进行分离，柱子口径大，一般要有切割承样的尾接装置；后者是分析柱，主要目的是对小量样品进行分析，柱子直径小，一般还有柱温箱，对泵的稳定性要求高，必须接检测器。

凝胶种类及性质

1、Sephadex G

交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200克每克干胶吸水20克。交联葡聚糖凝胶的种类有G-10，G-15，G-25，G-50，G-75，G-100，G-150，和G-200。因此，“G”反映，凝胶的交联程度，膨胀程度及分部范围。

2、Sephadex LH-20

Sephadex LH-20是─Sephadex G-25的羧丙基衍生物， 能溶于水及亲脂溶剂，用于分离不溶于水的物质。交联葡聚糖和琼脂糖都是多糖类物质，防止微生物的生长，在凝胶层析中十分重要，常用的抑菌剂有：

（1）叠氨钠（NaN3）

在凝胶层析中只要用0.02%叠氮钠已足够防止微生物的生长，叠氮钠易溶一水，在20℃时约为40%；它不与蛋白质或碳水化合物相互作用，因此叠氮钠不影响抗体活力；不会改变蛋白质和碳水化合物的层析我特性。叠氮钠可干扰荧光标记蛋白质。

（2）可乐酮[Cl3C-C(OH)(CH3)2]

在凝胶层析中使用浓度为0.01-0.02%。在微酸性溶液中它的杀菌效果Z佳，在强碱性溶液中或温度高于60℃时易引起分解而失效。

（3）乙基汞代巯基水杨酸钠

在凝胶层析中作为抑菌剂使用浓度为0.05-0. 01%。在微酸性溶液中Z为有效。重金属离子可使乙基代巯基的物质结合，因而包含疏基的蛋白质可在不同程度上降低它的抑菌效果。

（4）苯基汞代盐

在凝胶层析中使用浓度为0.001-0.01%。在微碱性溶液中抑效果Z佳，长时间放置时可与卤素、硝酸根离子作用而产生沉淀；还原剂可引起此化合物分解；含疏基的物质亦可降低或抑制它的抑菌作用。

使用凝胶色谱仪的注意事项

溶剂准备：使用HPLC纯溶剂，如有必要，进行过滤。保证溶剂的相溶性，避免使用对不锈钢有腐蚀性的溶剂。

溶剂脱气：超声脱气。

样品准备：过滤样品，确保样品中不含固体颗粒，用流动相溶解样品。

1色谱柱的保护

1、防止气体进入色谱柱。凝胶柱是不允许气泡进入的，否则将会使柱效降低甚至形成微小的难以驱除的气室。因此，为了防止气泡进入色谱柱，一定要使用经过脱气的流动相，并且要严格按照下列步骤来安装色谱柱。

a.拆卸下色谱柱入口处的密封螺丝，观察是否有溶剂渗出；

b.如有溶剂渗出，即可将色谱柱接到管路上，以避免气泡的进入；

c.如无溶剂渗出时，表明色谱柱的此端已经进去空气了，此时，可将色谱柱的出口端接到进样阀上，以流动相来反方向冲洗色谱柱，以便将柱内的空气排除。最好以0.2ml/min的小流量来冲色谱柱，如果溶剂的流速太快或者是压力突然的上升都将会导致柱性能的降低；

d.如果流出的溶剂里不含有气泡，说明柱内的气体已经被排出了，再将色谱柱以正确的方向接好，这样气泡就进不到色谱柱里面了。

2、色谱柱的清洗

为了不使被测物质和杂质停留在色谱柱中，在每次的样品分析工作完成之后，都应及时地清洗色谱柱。首先要用对被测样品洗脱能力强的溶剂来洗脱色谱柱，以分析工作中常用的反相色谱分析法为例，因其先流出的物质是极性大的物质，此时应用100%的甲醇或使用异丙纯、四氢呋喃等极性稍弱的溶剂将吸附在柱内的极性小的物质洗脱下来，洗脱液的用量一般为柱体积的20倍即可。如果流动相是缓冲溶液，则应先用蒸馏水来冲洗色谱柱，以冲掉柱内的盐，然后再用合适的溶剂来冲洗。

凝胶滤过色谱法(Gel Filtration Chromatography)中所使用的凝胶柱常用缓冲溶液做流动相，用完之后当然要用蒸馏水来冲洗。如果是连续操作，可以将缓冲溶液置于柱内过夜，但最好是维持小流速(＜0.5ml/min)以防止缓冲盐的析出，如果流动相中含有卤化物，即使是停一夜，也必须要用蒸馏水将色谱柱冲洗干净，以防止它们对柱体的腐蚀。

3、色谱柱的存放

如果色谱柱暂时不用，存放时要注意以下几点：

a.几天之内的短期放置，凝胶柱则用蒸馏水来冲洗，再把色谱柱的两头用密封螺丝密封好即可。

b.如果色谱柱长期不用，仅用上述方法来处理就不行了，这时应使用色谱柱使用说明书中所指明的溶剂来充满色谱柱，凝胶柱则不能用水了，因柱内如果有微生物的生长则会使柱效降低，此时应用0.05%的NaNs水溶液(防腐剂)来冲洗色谱柱，再将色谱柱封严。色谱柱长期放置时，一定要将色谱柱的两端封严，以防止由于溶剂挥发而造成的柱填料干缩现象，因这可导致柱效的严重降低。

c.色谱柱应贮存在室温下，如果放置于0℃以下的环境里，柱内就会结冰，这也将导致柱效的降低。

4、不要高温使用

5、不要高压冲洗柱子

6、对仪器的维护和保养进行记录