色谱峰问题

色谱峰的问题，如色谱峰分离度差、色谱峰过宽、色谱峰分叉、色谱峰拖尾或前沿以及鬼峰等，通常是由色谱柱及其与流动相和样品/稀释剂的相互作用引起的。

色谱图中无峰：原因有很多，包括进样器没有进样、泵没有提供相应的流量、漏液严重、检测器死机、数据系统接线错误、流动相不正确、色谱柱保留性或吸附性特别差或样品不正确。诊断此类问题的最佳程序是回到参考测试条件（通俗来说，就是之前好的且稳定的仪器条件）。如果可以成功复制参考条件，从而推断出系统运行正常，那么就可以针对具体的应用条件（色谱柱、流动相、样品等）进行故障诊断。

色谱峰过宽或分裂：异常宽的峰和分裂峰是色谱柱性能下降的表现，其原因是样品污染、部分入口筛板堵塞或色谱柱的柱效严重下降（图 1 和 2）。

图 1.可能由色谱柱空洞引起的色谱峰分裂示例。

图 2. 因暴露于高 pH 值流动相而导致：性能良好的 C18 硅胶色谱柱和性能不佳的 C18 硅胶色谱柱的色谱图对比。

可通过反向冲洗色谱柱、在色谱柱入口处重新填充填料或更换色谱柱（现在更常见的方法是更换色谱柱）来解决这些问题。请注意，早期洗脱峰的色谱峰比预期的要宽，这通常是由于高效液相色谱系统的柱外谱带展宽造成的（图 3）。对于小内径的超高效液相色谱柱而言，这些柱外展宽效应尤其有害。

图 3.  仪器谱带展宽的影响示例，表明早期洗脱峰受到的影响更大。

若样品溶液的溶剂强度大于流动相强度也会导致峰形异常（图 4）。如果可能，用于溶解样品的稀释剂的强度应与流动相 A (MPA) 或梯度分析中的初始流动相相同或更弱。如果必须使用强度较高的溶剂作为最终样品稀释剂，则应保持较小的进样体积（例如 HPLC 中 <2 ~ 5 μl），以防止早期洗脱峰的峰宽变宽或峰分裂。当样品的 pH 值与流动相的 pH 值完全不同时，也会导致峰分裂。

图 4. 用弱于和强于流动相强度的不同稀释剂注入同一样品溶液时出现的色谱峰异常示例。

倒峰：色谱图中的倒峰或凹陷常见于溶剂前沿附近。它们是由折射率变化或吸光度低于流动相的样品溶剂引起的。在溶剂前沿之后开始积分，通常可以忽略这些基线扰动。如果所有峰都是倒峰的，则可能是检测器导线连接的极性错误，除非使用间接紫外检测技术。在使用 RI 检测器时，倒峰更为常见。

鬼峰和额外峰：与空白梯度分析（仅注入样品溶剂进行梯度分析）相关的鬼峰通常是由较弱的流动相 (MPA) 中的痕量污染物造成的。通过使用纯化试剂和采取严格的流动相制备预防措施，可将这种情况降至最低。意外的额外色谱峰，特别是那些异常宽的色谱峰，通常是由等度分析过程中先前进样的后期洗脱色谱峰造成的（图 5）。其中一些峰可能非常宽，以至于经常被误认为是基线漂移。

图 5. 上一次进样中的高保留峰洗脱造成意外宽峰的示例。

数据性能问题

精度差和结果不准确等数据性能问题可能很难诊断。数据问题可能源于系统故障或与流动相、方法校准或样品制备有关的问题。几篇已发表的文章（见文末）介绍了保留时间和峰面积的系统精度差及其可能的原因和补救措施。色谱法准确度差的原因可能是色谱峰共洗脱（色谱峰纯度）、样品稳定性、样品制备/回收问题、基质干扰、设备校准或积分问题（图 6）。

图 6.各种色谱峰积分问题示例

一个很好的指导原则是，打印报告时一定要显示色谱峰基线，以检查峰面积积分是否正确。出现数据问题时，通常需要经验丰富的从业人员提供正确的诊断和补救方法。如后期案例所示，应通过消除每个潜在原因来进一步调查这些问题。