初始污染菌检验方法验证的目的是确保初始污染菌检验方法的适用性，从而保证检验结果的准确性。初始污染菌的数量可以反映出车间环境卫生的清洁度，与产品灭菌工艺、成品热原及内毒素有直接关系，故而要对其检测方法进行验证，确认其有效性及检测准确性，从而优化产品灭菌工艺及控制产品热原及内毒素，确保产品的安全性。

初始污染菌也称初始生物负载（bioburden）指产品或无菌屏障系统表面或内部的活微生物数量。不同国家对不同产品的生物负载有不同的要求。

初始污染菌检查时培养基的选择，医疗器械产品初始污染菌中培养基适用性检查菌种传代数不要超过5代，菌种种类目前主要有5种：

大肠埃希菌  CMCC(B) 44 102

金黄色葡萄球菌 CMCC(B) 26 003

枯草芽孢杆菌 CMCC(B) 63 501

白色念珠菌CMCC(F) 98 001

黑曲霉菌 CMCC(F)  98 003

获取菌种的方法：可从药检所采购自行培养稀释，它的缺点是操作繁琐，工作量大，菌数不准确。所以目前大多数企业都会选择商业化的培养基灵敏度指示剂，优点是方便，可以在5min之内完成操作，并且菌数准确。主要步骤是将指示剂进行溶解混匀，取100ul接种，然后培养，所以说操作简便，菌量准确。

接种数量50-100CFU，不同的培养基接种的微生物种类不同而有所不同。供试品对照组制备：取制备好的供试液100ml， 以稀释液代替菌液同试验组操作。

阴性对照组为确认试验条件是否符合要求所进行阴性对照试验，阴性对照试验应无菌生长。如阴性对照有菌生长，应进行偏差调查。

样品份额（SIP)，当整个样品不可能全部用于无菌检查时，可用样品的其中一部分用于无菌检查。

若不知道产品在微生物的分布，根据材料组成的比例来随机选择SIP。

若知道产品上的微生物是均匀分布的，则SIP可以从产品的任意部分选择。

若知道产品上的微生物分布但分布又不均匀，则SIP可以选择灭菌过程中最难灭菌的部位，或根据材料组成的比例来随机选择SIP。应尽力尽快将试验样品移至实验室。如果必须推迟转送，在试验样品的保存条件应能避免微生物的丢失或改变。应规定贮存最长时间。干燥能成为微生物数量明显减少的原因，所以在选择贮存条件和贮存时间时应加以考虑。

计数方法适用性试验中，采用平皿法或薄膜过滤法时，分为四个组，试验组、菌液组、供试品对照组、洗脱液对照组。

验证试验应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌的每次试验回收率。试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2 范围内。阴性对照试验应无菌生长。

测定值

修正系数验证，修正系数、回收率用于补偿无法从产品或培养基中完全去除微生物的数值。对某一特定的技术从产品上移除或培养微生物的能力的测定值。

修正系数=1/回收率。

回收率=（洗脱一次得到的微生物数量/ 接种的微生物数量）×100%

回收率=（洗脱一次得到的微生物数量/ 洗脱N得到的微生物总数）×100%

方法的回收率≥ 50%（0.5），药典要求≥70%，应评估产品理化特性、物理的处理方法对微生物的影响，在3次独立的平行试验中，回收率均应大于70%，则证明方法有效，若发现回收率低于70%，则应排除干扰，重新验证，或选择回收率接近要求的方法和试验条件进行试验。

浸提液：0.9%无菌氯化钠溶液，取至少三个样品，向单个样品中加入适量浸提液，充分震摇后收集于已灭菌容器中，即得第一次洗脱液。同法洗脱第二次、第三次、第四次。

采用开放式薄膜过滤法，每张滤膜过滤适量供试液，用适量浸提介质冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于培养基上，每个样品分别接种于胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基各1个。另取浸提介100mL 同法操作，作为阴性对照。以上两种培养基分别于 35℃和 25℃培养培养5天。

在计数时，分离到以前未遇到过的微生物，则应对其特征进行研究，并对其在生产过程，包括灭菌过程的潜在影响加以考虑和记录存档。

初始污染菌计数结果应符合标准规定的限值。应采用用统计学分析的一些结果，如minitab、JMP，其优点为可以发现被随机误差和已知的周期性波动，如季节变换所掩盖的一个细菌污染逐级向上的趋势。通常微生物的数值在一段时间都保持在一个稳定的水平，然后很短时间内出现一个明显的尖峰。这个尖峰的出现频率应该被重点监测，看其频率的变化情况以及是否符合影响初始污染。

偏差与变更控制，在确认过程中如有不符合法规标准或检验的情况发生，实验员应分析原因，找出原因，进行纠正或改进以达到要求，否则方法不能投入使用。验证执行中若有对已批准既定方案等变更，以及验证结束后决定对验证对象进行必要变更的，必须报上级领导。必要时对可能影响产品质量、安全性或有效性的主要变更进行评估，确定是否需要变更后重新验证。

参考资料 ：

《医疗器械生产质量管理规范》

GB/T 19973.1-2015《医疗器械的灭菌微生物学方法 第 1 部分：产品上微生物总数的测定》

《中国药典》2020 年版四部 1105 非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法