在进行药物的有关物质检查时，多采用高效液相色谱法，其计算方法有外标法、加校正因子的自身对照法、自身对照法及峰面积归一化法。其中加校正因子的自身对照法定量准确，又无需在每次检测时均提供杂质对照品，是目前较为常用的一种方法。小编在此对校正因子的测定以及校正因子准确度的验证进行简述。

一、校正因子的测定

校正因子的测定有单点法、多点法、标准曲线法及吸收系数比值法。已有多篇文献报道过各方法的基本操作及优缺点，在此不再赘述。在进行校正因子测定时，小编建议采用标准曲线法，因为线性试验是方法验证必不可少的一项内容，在此采用标准曲线法，既验证了杂质对照品及主成分的线性，又可得到准确的校正因子，可谓一举两得。

在进行校正因子的测定时，首先将各杂质对照品及主成分对照品配制成一定浓度的储备液，逐步稀释，直至找到各杂质的定量限，线性范围应包括定量限浓度~限度浓度的150%，主成分的浓度范围应包括定量限浓度~自身对照浓度的150%。例如，有关物质测定时，供试品的浓度为1mg/ml，采用0.1%的自身对照（即自身对照的浓度为1μg/ml），杂质A的限度为0.1%（即杂质A的限度浓度为1μg/ml），假设主成分及杂质A的定量限均为20ng/ml，则杂质A和主成分应在20ng/ml~1.5μg/ml的范围将浓度与峰面积进行线性回归，相关系数应大于0.990，Y轴截距应在100%响应值的25%以内。绘制出各杂质及主成分的线性曲线后，各杂质与主成分线性方程斜率的比值即为该杂质的校正因子。若杂质的校正因子在0.9~1.1的范围内，无需验证，直接采用自身对照法，若杂质的校正因子0.2~5.0之间，则需要采用加校正因子的自身对照法，若杂质的校正因子小于0.2或大于5.0，可考虑变换杂质的检测波长，重新进行测定，若所有的测定均在0.2~5.0之外，则表示加校正因子的自身的对照法不适用，需要用外标法进行定量。

在配制各浓度的线性溶液时，一定注意需逐级稀释，要避免出现下图1所示的情况，应如图2所示，保证个点分布的均匀性。

图1  不正确的线性试验设计

图2 正确的线性试验设计

二、相对校正因子及相对保留时间耐用性的考察

在采用加校正因子的自身对照法进行定量时，一般采用相对保留时间对杂质进行定位，在此，一并对相对校正因子及相对保留时间的耐用性进行考察。

具体考察方法同其他方法验证的耐用性试验，即变换波长、流速、柱温、流动相比例、流动相pH值、采用不同品牌的色谱柱、仪器等。将各杂质对照品与主成分配制成混合对照品溶液，采用标准曲线法，绘制各条件下杂质对照品及主成分对照品的线性方程，计算校正因子，同时计算出各条件下杂质对照品相对于主成分的相对保留时间。

对相对校正因子，除波长的变化会对相对校正因子有所影响外，其余色谱条件的调整均不会对相对校正因子产生影响，因此，测定波长的选择要避开吸光度急剧变化的位置，应选择在最大吸收或最小吸收的位置。校正因子的变化范围在多少范围内可以接受，目前，没有定论，小编认为，如果最终标准中相对校正因子只保留到小数点后一位，例如0.7，则各条件下校正因子均控制在0.65~0.74范围内，即可判定耐用性较好。即采用有效数字的修约规则，修约后为标准中规定的数值即可。

对相对保留时间，除波长的变化对其没有影响外，其余各条件的变化均会对其产生影响，为了保证对杂质的准确定位，必须对相对保留时间的耐用性进行考察。此处的试验不是为了证明相对保留时间的耐用性良好，而是通过耐用性考察确定出如何采用相对保留时间对杂质进行定位。例如，固定色谱柱的填料及品牌，固定主峰的保留时间等。至于RRT在多少范围内可以接受，不能一概而论，若杂质谱较复杂，则质量标准中的RRT需要保留至小数点后两位，如果杂质谱相对简单，各杂质距离较远，RRT保留至小数点后一位即可。在此，跟大家分享另外一个经验，即如果某些杂质的相对保留时间无法固定，随色谱参数的变化较明显，则可以采用将主成分进行定向破坏，通过系统适用性试验来对杂质进行定位。

三、相对校正因子准确度的考察

配制相同的供试品溶液，同时采用加校正因子的自身对照法及外标法，对供试品中的杂质含量进行测定，对两种方法的测定结果进行比较，校正因子与外标法计算结果的负偏差不得过0.05%，正偏差不做规定。若供试品中检出的杂质较少，可在供试品中加入一定量的杂质对照品，来进行测定。

至此，可将相对校正因子固化到质量标准中，采用加校正因子的自身对照法对已知杂质进行定量计算，既保证了定量结果的准确，又简化了试验，节省了对照品的用量。