盐酸替罗非班氯化钠注射液是一种可用于预防早期心肌梗死的药品——其主要有效成分替罗非班存在两种构型，即S构型和R构型，其中只有S-替罗非班才具有治疗效果，对于R-替罗非班则需要将其作为杂质进行控制。本文建立了一种用正相液相色谱法测定R-替罗非班含量的方法，并对其专属性、检测限、定量限等指标进行了验证，证明了该方法的准确性及可靠性。
盐酸替罗非班氯化钠注射液用于治疗在末次胸痛发作12h之内且伴有心电图（ECG）改变和/或心肌酶升高的非ST段抬高型急性冠脉综合症（NSTE-ACS）成年患者，以预防早期心肌梗死。
目前已有国内外研究证明：盐酸替罗非班可有效改善AMI患者急诊PCI后的心功能，减轻心肌损伤，提高微血管灌注，且安全性较高[1]，用于急性心肌梗死患者的治疗能取得较好的效果；此外，该药品还可促使患者的心肌微循环恢复正常，有效改善血浆纤溶因子与凝血因子水平，减少内皮细胞凋亡数，因此非常值得临床应用[2]。很多其他药物与盐酸替罗非班联合使用也均可获得优于单一用药的良好临床疗效，其他药物包括阿司匹林[3]、黄芪桂枝五物汤[4]、氯吡格雷[5]、肌氨肽苷[6]、补阳还伍汤[7]、低分子肝素[8]、清热活血汤[9]等。
盐酸替罗非班氯化钠注射液中的有效成分替罗非班具有手性碳原子，在合成过程中会存在两种构型，即S构型和R构型，其中只有S-替罗非班才具有治疗效果，R-替罗非班则为杂质，需要对其进行控制。一般采用正相色谱法检验盐酸替罗非班原料药中的R-替罗非班，但该方法中不能含有水相，无法适用于盐酸替罗非班氯化钠注射液。过往文献中有部分研究人员采用反向色谱法测量R-替罗非班的含量，但测试结果显示R-替罗非班与主药S-替罗非班分离度达不到要求，灵敏度低，且基线干扰大，方法适用性差，且通过方法优化后，分离度也无明显改善。
本文采用正相液相色谱法对R-替罗非班进行检测，通过使用固相萃取小柱除去了盐酸替罗非班氯化钠注射液中的水相，并对R-替罗非班进行了富集，从而提高了检测的灵敏度。
1、实验材料
1.1 仪器设备
高效液相色谱仪（Agilent 1260，安捷伦），电子天平（MSA6.6S-OCE-DM，赛多利斯），色谱柱（CHIRACPAK® IC，大赛璐），固相萃取小柱等。
1.2 试剂试液
R-替罗非班对照品（批号1861-098A1，TLC），正己烷（批号19130917G905，n-Hexane），异丙醇（批号TAVGIH，霍尼韦尔），甲醇（批号WXBD1024V，Sigma），乙二胺（批号201912053，湖南汇虹试剂），三氟乙酸（批号C10919649，国药集团），盐酸替罗非班氯化钠注射液（批号K20030201S，湖南科伦制药），氯化钠（批号180810，河北华晨药业）。
2、实验方法
2.1 溶液的配制
配制对照品贮备液：精密称取R-替罗非班对照品2.5 mg，置50 ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀。
配制对照品溶液：精密量取对照品贮备液1 ml，置100 ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀。
配制供试品溶液：取盐酸替罗非班氯化钠注射液50 ml，通过已活化（用5 ml甲醇和5 ml超纯水依次冲洗）的C18固相萃取小柱，待溶液滴尽后，用约10 ml的水冲洗，然后弃去水洗液，加甲醇5 ml洗脱至10 ml量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀。
配制系统适用性溶液：精密量取盐酸替罗非班氯化钠注射液50 ml，加入对照品贮备液1 ml，照供试品溶液进行制备。
配制辅料空白溶液：称取氯化钠4.50 g，加水500 ml溶解，量取50 ml，照供试品溶液进行制备。
2.2 分析方法
色谱柱采用纤维素-三（3，5-二氯苯基氨基甲酸酯）键合硅胶为填充剂（CHIRALPAK IC，条件为4.6 mm×250 mm，5 μm）；以正己烷-异丙醇-甲醇-乙二胺-三氟乙酸（400∶400∶300∶3∶3）为流动相；紫外检测器，检测波长为227 nm；流速为1.0 ml/min，进样量20 μl。
3、实验结果
3.1 方法的专属性
（1）配制溶液
配制酸降解溶液：取盐酸替罗非班氯化钠注射液50 ml，加入2 mol/l HCl 1 ml，室温放置24h，加入2 mol/LNaOH 1 ml中和后，照供试品溶液进行制备。
配制碱降解溶液：取盐酸替罗非班氯化钠注射液50 ml，加入2 mol/l NaOH 1 ml，室温放置24h，加入2 mol/l HCl 1 ml中和后，照供试品溶液进行制备。
配制氧化降解溶液：取盐酸替罗非班氯化钠注射液50 ml，加入3% H2O2 1 ml，室温放置24h，照供试品溶液进行制备。
配制高温降解溶液：取盐酸替罗非班氯化钠注射液于120℃加热4 h，精密量取50 ml，照供试品溶液进行制备。
配制光降解溶液：取本品在5000 LX光照箱中放置10天；精密量取光照样品50 ml，照供试品溶液进行制备。
不同溶液的检测结果
（a）酸降解溶液
（b）碱降解溶液
（c）氧化降解溶液
（d）高温降解溶液
（2）测定结果
测定的典型图谱如图1、图2所示，可以看出，阴性空白溶液不干扰R-替罗非班的检验，系统适用性溶液中R-替罗非班与S-替罗非班分离度良好，酸、碱、氧化和高温降解溶液中R-替罗非班与相邻峰之间的分离度也符合要求。
图1 阴性空白溶液检测结果
图2 系统适用性溶液检测结果
3.2 检测限与定量限
取2.1中的对照品贮备液适量，逐级稀释，以3∶1信噪比对应的浓度作为检测限，以10∶1信噪比对应的浓度作为定量限。结果R-替罗非班的检测限为0.0474 μg/ml，定量限为0.0948 μg/ml，这表明方法的灵敏度符合要求。
3.3 线性关系考察
取2.1中的对照品贮备液适量，用流动相将其浓度稀释为0.0948 μg/ml～0.9483 μg/ml的线性溶液，按照2.2中的方法进行测定。对于测定结果，以浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行线性回归。结果可得线性方程y= 29295.8077x－361.9512，相关系数r为0.9995，Y轴截距为100%响应值的2.68%，这表明该方法的线性关系良好。
3.4 重复性试验
取同批次的盐酸替罗非班氯化钠注射液6份，每份精密量取50 ml，分别加入2.1中的对照品贮备液1 ml，混匀。然后，使其通过固相萃取小柱，并弃去水溶液，用甲醇5 ml洗脱至10 ml量瓶，用流动相定容至刻度。结果6份供试品溶液中R-替罗非班的平均含量为0.24%，RSD为1.18%（n=6），这表明方法的重复性良好。
3.5 准确度试验
精密量取2.1中的对照贮备液0.5 ml、1.0 ml、1.5 ml各3份，分别置于50 ml量瓶中，用盐酸替罗非班氯化钠注射液稀释至刻度，摇匀，配制回收率溶液测定。计算回收率，结果见表1，可以看到平均加样回收率为104.6%，RSD为1.10%（n=6）），这表明实验的准确性良好。
表1 准确度验证结果汇总
3.6 溶液稳定性考察
取2.1中的对照品溶液和供试品溶液于室温条件下放置，分别于实验开始后的0 h、5 h、10 h及24 h取样，按照2.2中的方法进行测定。结果表明对照品溶液和供试品溶液在室温放置24 h的过程中，峰面积的变化率均在10%以内，溶液的稳定性良好。
3.7 耐用性考察
考察试验条件下变化对结果的影响，检测波长为227 nm±3 nm，柱温为30℃±5℃，流速为1.0 ml/min±0.2 ml/min，流动相比例±50，甲醇洗脱量为5 ml±1 ml。结果R-替罗非班的平均检出含量为0.25%，RSD为4.72%（n=14），这表明方法的耐用性良好。
3.8 样品含量的测定
取三批盐酸替罗非班氯化钠注射液，用它们依次制备2.1中的供试品溶液，按照2.2中的方法进样检测，按外标法以峰面积计算。结果三批样品中R-替罗非班的含量均在0.2%以内。
4、结论
本文建立了一种测定盐酸替罗非班氯化钠注射液中R-替罗非班含量的新方法，通过固相萃取小柱除去了注射液中的水相，使得正向色谱法得以应用；并对R-替罗非班进行了富集，提高了检测的灵敏度。经实验验证，该方法的专属性、检测限、定量限、线性关系、重复性、准确度、溶液稳定性和耐用性等指标均符合要求，适用于盐酸替罗非班氯化钠注射液中R-替罗非班检查。
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