纳米技术是指在原子及分子水平研究、制造并运用纳米材料(结构尺寸在1-1000nm的材料)的技术[1]。在药学领域里利用其较小的分子结构，使很多生物活性物质(药物、核酸、多肽或蛋白质等)可以通过纳米技术来递送[2]。这些新型纳米给药系统(包括脂质体、纳米乳剂和纳米凝胶等[3])的出现提高了药物的生物相容性、靶向性、缓释性、稳定性和表面修饰性等特性[4-5]，将纳米技术在药学领域的应用推向了新高潮[6-9]。

用适当材料制成的大小在纳米数量级的具有纳米特性的粒子，被称为纳米载体。纳米载体多采用可降解材料，如聚合物[10-13]、石墨烯[14-15]、蛋白质[16-17]、糖类[18]等。其中蛋白质具有较好的成膜功能及凝胶化、乳化和保水能力，使其作为纳米载体，可与很多疏水性药物复合，优于其他纳米给药系统，表现更好的水溶性、靶向性、高生物利用度和低不良反应[19-24]，并能增强稳定性[25]。蛋白纳米载药系统常用的制备方法有:去溶剂化法、超声乳化法、pH-凝聚法、快速膨胀超临界溶液法、NabTM技术和自组装法等[26-31]。

综合近年国内外文献，以蛋白质作为纳米载体的蛋白种类主要有以下几种，见表1。

在以蛋白质为纳米载体的药物制剂中，2005年美国FDA批准了American Bio Science公司注射用紫杉醇(白蛋白结合型，商品名为Abraxane)，成为全球首个蛋白纳米制剂。该品种的上市应用为很多难溶性药物和靶向性差的药物制剂提供了新思路、新方法，此外如多西紫杉醇、雷帕霉素、烯丙基氨基格尔德霉素的白蛋白纳米制剂也已进入临床研究阶段[40]。在该类药物的研究过程中，运用现代分析技术和方法建立的质量控制体系以及其疗效阐明了纳米技术与蛋白质为载体相结合的靶向药物新剂型具有很好的发展前景[41-43]。本文主要对其近年来的质量研究进展和相应的分析方法进行综述。

以蛋白质为载体的纳米制剂的质量控制指标主要有：形态特征、粒径大小及其分布、Zeta电位、包封率、含量测定、稳定性、体外释放、晶型状态和溶血率等[44-47]，其中含量测定分为载体蛋白质和目标药物测定。

1、 粒径

药物制剂的给药途径不同其粒径标准要求也不同，药物制剂的粒径大小及粒径分布决定其安全性、有效性、稳定性，因此制定粒径及粒径分布范围是药物制剂质量控制的重要指标。有文献报道[48]在粒径较小的范围内，可获得较好的药物包封率和载药量及更好的稳定性和靶向性。影响其粒径及粒径分布的因素主要有温度、pH值、超声条件等。因此，采用先进的现代分析手段对以蛋白质为载体的纳米制剂的粒径进行测定，使操作简便、准确、可靠。

1.1 动态光散射(DLS)法

2017年，Yildiz等[49]、Raei等[50]分别采用DLS法、Malvern激光粒径仪对不同大小的纳米粒进行测定，或通过预处理，控制粒径大小，并使其粒径分布指数(PDI)在一定范围内。如Yildiz等[49]的研究得到其中最小粒径为(27.1±1)nm的纳米球聚集体，与其他样品相比，增强了溶解度、抗氧化活性及功能性。

Shkodra-Pula等[51]在2019年通过DLS法分析颗粒粒径和分散性，考察了不同表面活性剂对纳米粒的稳定性影响，结果表明，在150-220nm之间形成的纳米粒是一个有利于靶向传递的粒径范围。

同年，Pradhan等[52]用Malvern激光粒径仪通过动态光散射法，测定其白蛋白纳米粒径为(137.63±6.42)nm和PDI为(0.195±0.014)，Zeta电位为(15±0.3)mV。细胞学研究结果表明，该阳离子化聚合物接枝白蛋白纳米粒可以改变血脑屏障的通透性，具有较强的脑部靶向作用。

因此，通常采用DLS法测定以蛋白质为载体的纳米药物制剂的粒径及粒径分布、Zeta电位[53]。Chen等[54]、Assadpour等[55]、Gul等[56]研究发现通过控制粒径在<200nm的范围内可以获得更好的生物利用度、抗氧化活性和稳定性。

1.2 扫描电子显微镜《SEM)

邢化朝等[57]于2016年采用扫描电镜法，分析放大3万倍下的扫描电镜图，通过校准系数乘以平均粒径得到最终平均粒径为103.1nm，与标准物质给定粒径值吻合，结果可靠。虽然，扫描电镜操作简便，容易观察，但显微镜的体积大、成本高，且样品必须承受极端的真空条件。因此，随着现代分析仪器的进步，一般仅采用扫描电子显微镜测定粒子形貌和初步粒径分析。

1.3 透射电镜(TEM)法

TEM是一种高分辨电子显微镜，可用于高分子、生物样品的测定，且对样品的损坏较小。代昭等[58]利用透射电子显微镜对纳米粒子的形貌和粒径进行表征，从电镜结果中可清晰观察到粒径为4nm左右的纳米粒子，且粒径分布较窄。

1.4 紫外-可见光谱(UV)法

UV法基于Beer-Lambert定律，主要用于对共轭有机化合物、过渡金属和大分子的定量分析。由于大多数纳米粒子都是彩色的，因此可以很容易地获得它们的光学和光催化性能，可以利用该技术研究纳米粒子的反射率、吸收、磷光和荧光等性质，随着纳米粒子粒径的增大，吸收光谱呈现红移[59-61]。

2、 含量测定

2.1 白蛋白的测定

在药学领域中以蛋白质为载体的纳米制剂，应用较多为白蛋白。白蛋白性质较稳定，对pH值、温度、有机溶剂都具有一定的耐受性，因而适用于多种纳米粒的制备[62]，其中常用人血清白蛋白(HSA)和牛血清白蛋白(BSA)作为纳米载体。白蛋白在维持血浆压力和营养平衡中起着关键作用，化合物通过与血液中的白蛋白结合来运输。此外，人类健康与血清白蛋白浓度密切相关，需对蛋白含量进行测定。

2.1.1 一般方法

《中华人民共和国药典》2015年版中，采用免疫双扩散法和免疫电泳法鉴定白蛋白，凯氏定氮法对白蛋白成品进行蛋白质含量测定[63]。在以蛋白质为载体的纳米制剂中，电化学阻抗谱、近红外漫反射谱、毛细管电泳和光散射技术等在检测白蛋白时选择性强、灵敏度高，但是操作步骤复杂、重现性差、费时[64]。

2.1.2 高效液相色谱(HPLC)法 

白蛋白为大分子物质，采用一般分析柱不能得到较好的分离结果，应采用大分子填充柱。曲娜[65]在对人血清白蛋白体外分析方法建立中，采用色谱柱为Toso Hass TSK G3000PWXL柱(300mm X7.8mm，5um)，以0.1mol·L-1磷酸二氢钾溶液[用盐酸调pH至(7.0±0.1)]为流动相，检测波长为228nm，柱温为30℃，流速为1.0 mL·min-1，进样量为20uL，对白蛋白进行鉴别和含量测定。

因此，开发简便可靠、快速灵敏、准确度高、选择性强的新方法，对蛋白检测极为重要。目前应用研究较理想的检测手段为生物传感手段，其设计简单、精确度高，在最短的时间内可检测出微量的白蛋白[66]。

2.2 载药含量的测定

2.2.1 前处理方法 

以蛋白质为载体的纳米药物通常制备为冻干制剂，因此需要筛选合理的前处理方法，达到能够准确测定其复合物载药量的目的。

闫淑娟[67]在对JD27白蛋白纳米粒的初步性能研究中，取白蛋白纳米粒适量，15000r·min-1离心30min后分离游离药物，收集纳米粒，用水稀释适量，加入1mL乙腈沉淀蛋白，涡旋3min，超声30min，12000r·min-1离心15min，取上清吹干，然后用1mL甲醇复溶后，测定白蛋白纳米粒中药物含量。

高越[68]在对紫杉醇白蛋白纳米粒研究中表明，纯化水溶解纳米粒冻干粉后，取适量稀释液于超滤离心管中，以12000r·min。超滤离心30min，取滤液进行测定游离药物含量。取纳米粒加入适量乙腈溶解，超声20min，将混合物以12000r·min-1离心10min，取上清液并进行分析，测定纳米颗粒中紫杉醇总含量。

邢高杨[69]在紫杉醇白蛋白纳米粒的质量标准研究中，采用0.9％氯化钠溶液对蛋白纳米粒进行复溶，再用乙腈溶解紫杉醇白蛋白纳米粒，涡旋1min后超声15min，再在4℃下，以5000r·min-1离心10min，取上清液进行紫杉醇含量测定，并对该方法进行了方法学验证。

2.2.2 HPLC法 

以蛋白质为载体的纳米制剂中，测定复合物中的载药含量，经过前处理分离后，通常采用HPLC法对包载药物进行测定。Thao等[70]在测定阿霉素和紫杉醇白蛋白纳米粒载药量和包封率时，采用Agilent PLRP-S柱(150mmX4.6mm，8um)进行反相高效液相色谱(RP-HPLC)分析，并配置Agilent保护滤柱(5mm×3mm)，流动相A[0.1％三氟乙酸(TFA)]和流动相B(0.1％TFA乙腈)进行梯度洗脱，流速为1.0mL·min-1，柱温为40℃，检测波长为220um。

2.2.3 其他测定方法 

在药动学及组织分布试验中，以蛋白质为载体的纳米制剂利用载药含量小而发挥其缓释作用，因此测定血浆中的药物含量时，通常采用液相色谱二级质谱联用(LC-MS/MS)进行分析[71-72]。

3、 药量比

3.1 药量比对粒径的影响

以蛋白质为纳米载体的药物制剂中，药物和蛋白质载体的比例对复合物质量的影响较大。魏炜等[73]以牛血清蛋白为模型蛋白，N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)为单体，N，N-亚甲基双丙烯酰胺(BIS)为交联剂，制备了蛋白纳米胶囊，发现在一定范围内，随着药物和蛋白比例的升高，蛋白纳米胶囊的粒径也逐渐增大。

3.2 药量比对包封率和载药量的影响

陈卫[74]在伊曲康唑白蛋白纳米粒性能研究中，设定牛血清白蛋白浓度为2％，与药物溶液体积比为19:1，在药物溶液浓度分别为25，50和75mg·mL-1下分别制备纳米粒，结果表明，随着药物浓度增大，纳米粒的粒径随之递增，分别为(80.5±2.1)，(108.6±1.6)和(125.3±2.8)nm，载药量明显增加，分别为(5.5±0.2)％，(11.1±0.5)％和(14.2±1.1)％。

薛瑾[75]在茶多酚一蛋白纳米复合物的研究中发现，随着茶多酚-酪蛋白比例增加，在茶多酚与酪蛋白的摩尔比为10:1时，纳米复合物具有最小粒径和最大包封率。

3.3 药量比对稳定性的影响

通常粒径越小的蛋白纳米制剂具有更好的稳定性[76]。杨贵妃等[77]研究乳清蛋白与OSA变性淀粉质量比从10:0变化到3:7的过程中，纳米乳液的粒径显著增加，结果表明，随着蛋白质比例的减小，粒径增大，乳清蛋白溶解度降低，乳化能力减弱，从而使纳米乳液的稳定性降低。

王霞等[78]考察了不同米糠蛋A与葡萄糖比值对米糠蛋白乳化活性及稳定性的影响规律，结果表明，在蛋白与葡萄糖比例在1:1，1:2，1:3，1:4和1:5范围内，米糠蛋白乳化性和稳定性先增强后降低，葡萄糖比例增大为米糠蛋白提供更多的糖基化结合位点，而高比例葡萄糖使体系黏度增大，从而降低米糠蛋白溶液的稳定性。

3.4 药量比对靶向作用的影响

杨惠卿等[79]在细胞摄取影响因素实验中，考察当蛋白纳米载体(HSP)亚基与聚乙二醇丙烯酸共聚物(PSPA)的摩尔比分别为1:1，1:2，1:3时，2种蛋白纳米载体进人仓鼠肺成纤维细胞(CHL)细胞的情况，结果表明，投料比为1:1时无显著差异，而投料比为1:2和1:3时有显著差异，其抑制入胞作用显著强于1:1，而投料比1:2与1:3相比无显著差异。所以，当HSP亚基与PSPA的摩尔比超过1:2时，PSPA包衣可对pH敏感型热休克蛋白纳米载体(PT-HSP)进入正常细胞发挥抑制作用。

药物和蛋白质的用量比例对纳米复合物的粒径、包封率和稳定性的影响较大，还可影响其靶向作用。因此，控制以蛋白质为载体的纳米制剂的药量比，是保证药物满足稳定性和药物制剂要求的重要因素和指标。

4、 稳定性

药物的物理化学性质可能受湿度、光照、高温等影响，使其降低或失去活性，甚至产生毒性副产物。以蛋白质为纳米载体可以通过多种结合方式与药物形成纳米复合物，以有效降低其毒副作用，提高药物稳定性及靶向结合率[80]。

4.1 溶剂对稳定性的影响

以蛋白质为载体包载疏水性药物的纳米制剂可溶于水、甲醇、乙醇、乙腈等溶剂，对复合物溶液中的药物溶解后进行提取、分离，而以蛋白质为载体的纳米制剂的稳定性在不同介质中表现的性能不同。Rohiwal等[81]考察了在不同生物介质中牛血清蛋白纳米制剂的稳定性，研究表明，在葡萄糖、纯化水、NaCl溶液中的稳定性均高于磷酸盐缓冲液(PBS)。因此在含量测定、临床使用和贮藏运输过程中要考察溶剂对该类复合物稳定性的影响。

4.2 pH对稳定性的影响

溶液的pH环境会影响以蛋白质为载体的纳米制剂的结构性质，在不同的pH条件下，纳米制剂具有不同的结构，牛血清白蛋白是一种稳定的蛋白质，它的等电点一般在4.8-5.6[82]。Doost等[83]报道在制备树胶-乳清蛋白纳米复合物后，为改善其稳定性，讨论了不同pH下，以粒径和外观形状为指标，评价复合物的稳定性，结果表明pH值为4-5时比在pH值为3-4时更能诱导纳米复合物的稳定性。

Siri等[84]对牛血清A蛋白纳米粒采用FT-IR光谱实验测定不同pH条件下蛋白纳米结构的稳定性。结果表明，在pH2.0和9.0条件下，光谱发生蓝移，检测波长向左移动，而在pH7.0时，牛血清白蛋白纳米粒更能保持纳米粒自身的结构，稳定性更好。

5、 展望

近年来，在创新药物及药物新剂型的质量研究中，主要通过制定各项质量指标满足药品质量标准的要求，保障药品使用安全、有效和合理。在以蛋白质为载体的纳米制剂中，粒径作为该类制剂的主要质量评价指标之一[85-87]，其测定手段也需方便、快速、灵敏且有效。探索合理的前处理方法，运用现代分析技术手段建立快速、方便、灵敏的测定方法，评价和控制蛋白纳米制剂的粒径、包封率和载药量等，使其符合药物制剂质量要求。

此外，由于这类纳米制剂制备工艺的复杂性和贮存条件的苛刻要求，必须加强其稳定性研究。而且目前对此类复合物在溶解、释放、降解后产生的有关物质研究报道较少，其相关研究需要进一步探索和完善。同样，药物的安全性评价也是药物研究非常重要的环节。其不良反应可能是来自起始物料、中间体以及在生产、贮存过程中引入或受贮运条件影响而发生变化产生的有关物质。随着蛋白纳米制剂的广泛应用，其质量控制研究中有关物质检查已成为重点，并具有较大的研究空间。

文章作者 | 张金霞，李楠，李晓琴，王倩文，邓盛齐（成都大学抗生素研究与再评价四川省重点实验室，四川抗菌素工业研究所）

文章来源 | 中国新药杂志 2021年2月 第30卷4期333-338页