胶原蛋白是细胞外基质中重要的结构成分，分布于所有组织和器官。它不仅赋予组织强度、耐久性和弹性，还广泛参与各种生物过程。胶原蛋白应用广泛，涵盖医疗美容、功效护肤、严肃医疗及其他消费等领域。

肽图检测法

肽图检测法利用特定的化学试剂或酶将蛋白质特异性降解为肽段，然后通过分离和鉴定，并与经同一方法处理的对照品进行比较和结果判定。根据所选用的检测仪器不同，肽图分析可以分为基于高效液相色谱法的肽图分析和基于质谱法的肽图分析。

通过与对照品肽图的比较，可以对生产过程中的胶原蛋白的质量进行评估和监控，确保产品的一致性和质量稳定性。

基于反相高效液相色谱法的肽图分析

反相高效液相色谱（RP-HPLC）法是一种操作简单、检测灵敏度高的分析方法，可提供丰富的蛋白质和肽段信息，是蛋白质和肽段分析与表征的标准方法。

HPLC肽图分析通常用于常规鉴别试验。在该分析中，肽段经过色谱柱分离后，使用紫外检测器在波长范围200~230 nm（通常为214 nm）记录色谱图。通过将供试品溶液的色谱图与对照品相比较，最终可以对胶原蛋白类产品进行肽图鉴别。

HPLC肽图分析的实验步骤通常包括供试品和对照品的预处理（如溶解、变性）、胶原蛋白的特异性裂解、肽段的分离和检测，以及结果的分析和判定。

胶原蛋白相关标准及肽图检测依据

以上这些标准基本都是依据《中国药典》2020 四部 肽图检查法 法一或结合质谱法进行肽图分析的。

△《中国药典》2020 四部 3405 肽图检查法 法一 胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法

△《中国药典》2020 四部 0431 质谱法，采用适宜的质谱技术对各色谱峰对应的肽段进行定性

1、检测样品

牛I型胶原蛋白冻干品

2、实验仪器

高效液相色谱仪（紫外检测器）

高分辨液质联用仪

3、结果展示

牛I型胶原蛋白冻干品（供试品和对照品）酶解6 h后的样品经过HPLC的分离，紫外检测器采集数据，得到肽图结果，色谱图如图1。根据上述色谱图分析结果，可以发现供试品中的主要肽段出峰时间和相对比例（响应强度）与对照品基本一致。牛I型胶原蛋白冻干品（供试品和对照品）酶解6 h后的样品经过HPLC的分离，紫外检测器采集数据，得到肽图结果，色谱图如图1。

经过高分辨质谱对肽段进行进一步分析和验证，发现基本都是带两个或三个电荷肽段 ，如图2和图3所示。因此，进一步确认酶解确实生成了肽段，且供试品和对照品结果一致。

图1 胰蛋白酶酶解6 h的肽图

（黑色：空白对照；红色：对照品；蓝色：供试品）

图2 胰蛋白酶酶解6 h的TIC图

（红色：空白对照；绿色：对照品；紫色：供试品）

图3 提取12.6 min左右的质谱图

（紫色：空白对照；绿色：对照品；红色：供试品）

胶原蛋白的肽图分析除使用液相色谱法进行鉴别外，还可以使用 LC-MS/MS 对生成的特征多肽进行测定。以不同类型胶原蛋白特征多肽的保留时间(RT)和二级子离子碎片的质荷比(m/z)进行定性和确证，以合成的不同类型胶原蛋白特征多肽作为对照品，用外标法或内标法对胶原蛋白多肽进行定量，可以间接反映胶原蛋白的含量。