本期介绍的是在提取实验样本时各位同学反馈来的种种提问：

Q：如何从细胞中提取胶原蛋白？

A：对于胶原蛋白一般的提取方法是胃蛋白酶限制性降解法。其主要步骤是：在低温下刮取原料细胞，在丙酮中浸泡过夜以清除脂肪，然后清洗干净。加入少量乙酸与胃蛋白酶，酶量与湿组织量之比为1:100，再加入足量乙酸，使溶液中酶的终浓度为2 mg/mL。

搅拌过夜，但要避免过度消化。离心取上清液，通过盐析（如使用NaCl）或透析进一步浓缩和纯化胶原蛋白。纯化后可通过SDS-PAGE等方法进一步确定提取物中胶原蛋白的浓度和纯度。

酶提取法的注意事项：

1. 细胞外基质中的胶原蛋白可能与其他蛋白质和多糖紧密相连，因此提取过程需要特别注意不要破坏胶原蛋白的三级结构。

2.  提取条件（如pH、温度、酶的选择）需要根据所研究的细胞类型和胶原蛋白的类型（例如I、II、III型等）进行优化。

此外还有酸提取法。此法主要采用低离子浓度酸性条件破坏分子间盐键，从而引起纤维溶解。其优势是可以最大程度地保留蛋白的三级结构，但只能处理酸溶性的胶原蛋白。通常使用乙酸，如在pH2.5的条件下保持24小时。但由于种种不足，常与酶提取法联用。

另外还有一些不常用的方法，如盐析法、碱提取法、热水法等。这些方法相对提取效率不如前面介绍的两种。另外，任何实验都需要根据特定的实验条件和目的进行调整，不可以本本主义。

Q：提蛋白做WB发现其中有杂质，如何去除？

A：杂质一般是上一步裂解提蛋白时留下的，所以解决思路有2点：提蛋白时除杂彻底，电泳前再清理一次杂质。

提蛋白时加上超声破碎这一步操作：超声破碎10-15 min，然后冰浴；

电泳前将样本煮沸5 min，完全变性；离心5,000 × g ，5 min，取上清去电泳。注意如一些多次跨膜蛋白不应水煮，这方面需要多查阅资料。

Q：Trizol法提取RNA应该在室温条件下还是放在冰上操作呢？

A：这个问题作为基础实验，实际上在不同实验室的protocol里有不同操作标准（或说传统）。这边建议大家图中标记的两个位置的操作步骤都采用室温就可以，没有必要冰上孵育。第—步加入氯仿，主要是依靠震荡来实现分层，只要确保离心时间和速度就可以达到效果。

Q：提取核酸的过程中，涡旋振荡跟用力摇晃15秒不都差不多嘛，为什么书上说涡旋会导致DNA污染？

A：涡旋振荡产生的剪切力比手用力振荡的要剧烈很多，我们把离心管放在Vortex上涡旋只需要三五秒即可达到效果，手摇肯定是不行的。

因此可以说明涡旋振荡的力度之大，所以提取时使用涡旋会造成样本里面存在的基因组DNA断裂碎成短片段，这样的话就会和RNA混在一起，无法分层。

这里特指用trizol提取RNA的情形。涡旋造成的DNA断裂主要是针对有基因组DNA存在的情况下，因为基因组DNA特别长容易被拉扯断开，你可以想象一堆细绳，有的很长（基因组DNA）、有的很短（各种RNA），疯狂拉扯它们，细长的基因组DNA就容易在某个地方断开形成很多碎片。

基因组DNA的双螺旋结构本质上是一种化学稳定（惰性、几乎不参与化学反应）但物理结构上很脆弱的东西。

此外还有两条追加讨论：

提取完是否可以涡旋：提取完之后，就只有RNA了，涡旋没什么问题；

是否只涡旋三秒就没事了：还是不建议，因为没办法确保这三秒不出问题。

Q：提取成纤维细胞是不是不能用胰酶？因为它在间质里面，还是很难提的

A：在文献找到三种方法：贴块法，只用胰酶；消化法，胰酶联用胶原酶；商品化的分散酶。

虽然胰酶很常用，但我们认为盲目使用效率不高，消化组织块的能力有限。因为原代组织中是很多不同的细胞混杂在一起，如果只用胰蛋白酶进行消化，效率不够。

而胶原酶本身也有I II III IV四种，不同的胶原酶对应的适应组织不一样，要联合混用或配置特定比例才行。考虑到我们通常提到的胰酶、胶原酶往往是一个家族的酶的统称，实际操作时需要根据其不同分型专门选择。这里我们有一些文字材料以供参考，请点击视频收看。

Q：为什么要在4℃下低速离心提取植物外泌体？

A：主要是为了防止外泌体降解。

虽然外泌体其实没有那么脆弱，但离心出体外以后，主要要防止以下几点影响活性：

1.  抑制酶活性：低温下细胞内外的酶活性会被一定程度地抑制，尤其是蛋白酶和核酸酶，避免外泌体和内含物被降解。

2.  稳定蛋白质结构，避免蛋白质变性。

3.  降低代谢速率：其实也是因为降低酶活性，因此细胞代谢减慢，不会产生过多可能会干扰外泌体分离与鉴别的代谢物。