平板划线分离法:是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

为方便划线，一般培养基不宜太薄，每皿约倾倒20ml培养基，培养基应厚薄均匀，平板表面光滑。划线分离主要有分区划线法和连续划线法两种（如图1， A、B）。

图1

分区划线法是将平板分四区，故又称四分区划线法。划线时每次将平板转动60~70°划线，每换一次角度，应将接种环上的菌烧死后，再通过上次划线处划线；

另一种连续划线法是从平板边缘一点开始，连续作波浪式划线直到平板的另一端为止，当中不需灼烧接种环上的菌。

1）连续划线法

接种环于酒精灯外焰烧至红透，接种棒也要充分灼烧，最后再集中烧接种环至红。

轻轻摇匀待接种试管，左手手心托待接种试管底侧部，右手执接种环，右手小指拔下试管塞，于酒精灯附近将接种环伸进试管，稍候，再插入待接接种液中，蘸一下，取满一环，抽出、烧塞、盖盖、放回试管架。或将接种环通过稍打开皿盖的缝隙伸入平板，在平板边缘空白处接触一下使接种环冷却，然后以无菌操作接种环直接取平板上待分离纯化的菌落。

于靠近酒精灯处打开平皿盖约30°，右手将环伸进平皿，将菌种点种在平板边缘一处，轻轻涂布于琼脂培养基边缘（如图2），抽出接种环，盖上平皿盖，然后将接种环上多余的培养液在火焰中灼烧，打开平皿盖约30°伸入接种环，待接种环冷却后，再与接种液处轻轻接触，开始在平板表面轻巧滑动划线，接种环不要嵌入培养基内划破培养基，线条要平行密集，充分利用平板表面积，注意勿使前后两条线重叠，划线完毕，关上皿盖。灼烧接种环，待冷却后放置接种架上。培养皿倒置于适温的恒温箱内培养（以免培养过程皿盖冷凝水滴下，冲散已分离的菌落）。培养后在划线平板上观察沿划线处长出的菌落形态，镜检后再接种斜面。

图2

2）分区划线法

取菌、接种、培养方法与“连续划线法”相似。

分区划线法分离时平板分四个区，故又称四分区划线法。其中第4区是单菌落的主要分布区，故其划线面积应最大。为防止第4区内划线与1、2、3区线条相接触，应使4区线条与1区线条相平行，这样区与区间线条夹角最好保持120°左右。

先将接种环沾取少量菌在平板1区划3~5条平行线，取出接种环，左手关上皿盖，将平板转动60~70°，右手把接种环上多余菌体烧死，将烧红的接种环在平板边缘冷却，再按以上方法以1区划线的菌体为菌源，由1区向2区作第2次平行划线。第2次划线完毕，同时再把平皿转动约60~70°，同样依次在3、4区划线。划线完毕，灼烧接种环，关上皿盖，同上法培养，在划线区观察单菌落。

该法主要用于单个菌落的纯培养、保存菌种或观察细菌的某些特性。

（1）左手平托两支试管，拇指按住试管的底部。外侧一支试管是斜面上长有菌苔的菌种试管，内侧一支是待接的空白斜面，两支试管的斜面同时向上。用右手将试管塞旋松，以便在接种时容易拔出。

（2）右手拿接种环（如握毛笔一样），在火焰上先将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部位也过火灭菌．

（3）将两支试管的上端并齐，靠近火焰，用右手小指和掌心将两支试管的试管塞一并夹住拔出，试管塞仍夹在手中，然后让试管口缓缓过火焰。注意不得将试管塞随意丢于桌上受到沾污，试管口切勿烧得过烫以免炸裂。

（4）将已灼烧的接种环伸入外侧的菌种试管内。先把接种环的先端触及无菌苔的培养基上使其冷却（如果操作迅速，此时接种环尚未完全冷却）。再根据需要用接种环沾取一定量的菌苔，注意勿刮破培养基。将沾有菌苔的接种环迅速抽出试管，注意勿使接种环碰到管壁或管口上。

（5）迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管的底部，轻轻向上划线（直线或曲线，根据需要确定），勿划破培养基表面。

（6）接好种的斜面试管口再次过火焰，试管塞底部过火焰后立即塞入试管内。

（7）将沾有菌苔的接种环在火焰上烧红灭菌。先在内焰中烧灼，使其干燥后，再在外焰中烧红，以免菌苔骤热，会使菌体爆溅，造成污染。

（8）放下环后，再将试管塞旋紧，在试管外面上方距试管口2～3cm处贴上标签。

斜面接种方法及无菌操作过程如下具体操作过程见图3。

图3

用接种针经火焰灭菌，沾取少量菌种，垂直地穿入试管固体培养基中心至底部，然后将挑起菌落的接种针平行于管壁插入琼脂斜面底部、沿着原接种线将针拔出、烧试管塞和试管口、塞上试管塞，再将接种针上残留的菌体在火焰上烧掉。要做到手稳、动作轻巧快速。见下图4。（a:垂直接种法，b：水平接种法）

1）液体接种法

包括从外面菌种接入培养液，或从液体菌种接入液体培养液，两种情况都可以用接种环接种。但在培养量比较大的情况下，液体接种宜采用移液管接种，要求无菌操作。

左手持试管，右手将烧灼过的接种环伸入菌种管，待冷却后，取菌液一环，立即移入培养基管中，在接近液面的管壁上轻轻研磨，然后将试管稍倾斜，并沾取少许液体调和，使菌液混合于培养基中(图5，A)

2）半固体培养基接种法   

将烧灼过的接种针插入菌种管冷却后，沾取菌液少许，立即垂直插入半固体培养基的中心至接近于管底处，但不可直刺至管底，然后循原路退出(图5，B)。管口通过火焰，塞上棉塞，接种针烧灼灭菌后放下。

将上述已接种好的培养物，37℃度恒温箱内培养，24小时后取出观察结果。

用无菌移液管吸取菌悬液0.1mL，滴加于培养基平板上，右手持无菌涂布棒，左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，在火焰旁右手持涂布棒与培养皿平板表面将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散，切忌用力过猛将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。接种后，将平板倒置于恒温箱中，培养观察。（图6）