适用范围：

本思路仅适用于反向色谱法分析离子化合物方法开发中流动相pH的确定

在反相色谱分析中通常不要求化合物精确的pKa值，我们可以通过查阅文献以或者根据化合物的结构按照下图中列出的主要酸碱官能团在水溶液的pKa值进行推测。

注意：按照上表中官能团进行估算时分子中相邻基团的不同会导致pKa出现1-2个单位的差异。对于酸性化合物，当含有吸电子基团时会导致酸性增强，pKa值相应降低；对于碱性化合物，当含有吸电子基团时会导致碱性降低，pKa值相应降低。

先看下流动相pH对酸碱化合物的影响：

1.流动相pH对不同pKa化合物的保留时间的影响

请仔细观察上图，通过该图我们可以获得以下信息：

(1)调节流动相pH可改变离子化合物的保留

强酸及弱酸性化合物在酸性条件下会以分子形式存在，此时疏水性较高（极性大）在RPC的保留会较强。强碱及弱碱性化合物在碱性条件下多以分子形式存在，此时疏水性较高（极性大）在RPC的保留会较强。而中性化合物的保留基本与pH没有关系，不随pH的改变发生保留时间的变动。因此我们在方法开发的时候可以通过改变流动相的pH进行改变化合物的保留时间

(2)在pH3-9范围内微小的pH变化可能会引起保留时间的明显变化，因此建议方法开发初始pH调节范围在2～3，这样可以降低对pH略微变化的敏感性。

(3)如果是未知的化合物，调节pH值我们可以根据保留时间的变化推断化合物的酸碱性，比如保留时间随着pH的增大而延长的样品肯定是碱性化合物。

2.流动相pH对化合物峰型的影响

根据流动相pH对酸碱化合物的电离的影响，当化合物的pKa与流动相pH重合时会导致分子与离子形式共存，化合物的峰型不好。因此建议将pH控制在化合物的pKa±2的范围以外，此时化合物99%基本是以分子或者离子形式存在，峰型会更加的尖锐。

3.流动相pH对化合物的选择性的影响

根据这幅图，我们可以看出，当流动相的pH约等于化合物的pKa时，可以最大限度的调整化合物的保留时间。此时改变0.1个单位的pH可以使得保留因子k变化10%，可引起分离度±2.5个单位的变动。但此时需要进行精确控制流动相的pH，这要求把流动相pH控制在0.02个单位以内，在实验室很难控制，重现性较差，成为分析的瓶颈。

但我们实验时可以将pH范围放宽，只要将流动相pH控制在化合物pKa值±1.5个单位的范围内（上图所示的II范围内）就可以对化合物保留行为产生比较明显的影响，此时进行分离选择性较好。同时为了更好地控制保留行为的重现性，需要控制缓冲液的pH在±0.1个单位以内(当流动相pH控制范围较窄时建议使用缓冲盐的质量进行控制，比pH计进行控制效果更优)。

通过以上三点分析我们可以得出，待分析化合物的pKa与确定流动相的pH有很大的关系。主要依据化合物出峰时间、化合物的峰型及所需要分离目标的化合物综合考虑来确定流动相的pH。

可能有的同事会发现第二点和第三点是有些矛盾的，这时候就需要对自己的实验进行初步的探索，看看是否pH值会对化合物的峰型产生影响（有的专家认为该观点缺乏理论和实践的支持）或者是否需要准确调节pH在化合物pKa±1.5范围内进行提高选择性。

笔者在做实验时发现有的物质会因稀释液pH使用不当产生峰分叉的现象，调节稀释液的pH即可解决峰的分叉；有时流动相pH在化合物的pKa±2的范围内时离子化合物并没有出现峰分叉、峰型不好现象。

1.缓冲液选择主要依据：

（1）缓冲溶液的pKa和缓冲容量

（2）溶解度

（3）紫外吸收

2.对以上三点进行说明

(1)一般缓冲溶液的pKa值与流动相的pH相等时缓冲能力最大，pKa与流动相的pH相差越大，缓冲液的缓冲能力越差。一般要求流动相的pH与缓冲液的pKa值不能超过±1.0个单位，当缓冲溶液浓度较高时可以放宽范围到1.5个单位。常用的缓冲液的缓冲范围见下图：

缓冲溶液的浓度一般在5-50mmol，因过低导致缓冲能力不足（可通过调整进样体积查看化合物峰型的变化，如果出现拖尾或者前沿现象，说明缓冲溶液的能力不足）；缓冲液浓度过大会导致与有机相混溶时盐的析出，对仪器、色谱柱都会产生损伤，而且使得基线不好。一般初始摸索方法时推荐使用25mmol。

（2）根据缓冲液溶解度：在酸性缓冲溶液中，如磷酸盐，缓冲液溶解度顺序：钠盐＜钾盐＜铵盐；有研究发现，当pH=7时10mmol的磷酸钾在85%甲醇或者75%乙腈中可以溶解，在pH=3时，在85%甲醇或者85%乙腈中可以完全溶解（此测试通过使用容器将不同比例的混合溶剂进行混合，观察大约30min，是否有沉淀产生，否则就要降低缓冲液的浓度或者有机相的含量，在梯度洗脱时尤为注意）。

（3）根据化合物的吸收波长：在pH≤3.5，6.0≤pH≤8.5或者pH≥11.0磷酸盐缓冲液是不错的选择。而甲酸盐和乙酸盐缓冲液的范围是2.5～6.0，适用于210纳米或者更高吸收的检测波长

3. 缓冲盐的作用：

缓冲盐的种类或者浓度对选择性的改变会很小，只是起到缓冲作用，提高化合物的保留时间的稳定性。

以上就是方法开发中流动相pH确定的主要基本思路。笔者在做实验发现这些理论上的知识我们可能已经知道了，但是在运用到方法开发的时候并不是一帆风顺的。比如说我们最近做的一个苯胺类化合物，推测其为碱性，想象中改变流动相的pH应该会发生保留的变化，但是我们从酸性调节到碱性该化合物的保留却没有变动，后来我们分析可能是因该化合物有较强的吸电子基团导致碱性降低变成一个接近中性的物质，故保留时间不再受pH的影响。

笔者相信在方法开发时努力尝试使用理论知识去指导实践最终一定会取得较好的结果，而且会事半功倍。有时候理论无法去指导实践可能是因为我们的理论知识层面还没达到，有些地方可能没有注意到有其它条件的影响。但只要我们一直坚持使用知识去指导实践，通过实践来验证所学的知识，反复的相融合，不断的总结，落实到书面上，我们在方法开发时一定会越来越顺手。

参考文献：原：Lloyd R.Snyder,Joseph J.Kirkland, John W.Doln，译：陈晓明，唐雅妍。现代液相色谱技术导论（第三版）。