纳米注射剂是近年来高端制剂研发的热点，我国纳米注射剂仿制药研发水平尚在起步阶段，缺少相应的技术要求，此类制剂的研发和监管面临极大的挑战。本文对纳米注射剂仿制药与参比制剂药学一致性考察的要点进行了总结，重点讨论了粒径表征技术以及对相关参数进行体外群体生物等效性研究的方法及方法的科学性和可行性。纳米注射剂仿制药与参比制剂的药学等效性研究对我国纳米注射剂仿制产品的研发、规模化生产和质量控制具有重要的借鉴意义。

纳米技术在医学上的应用，使得疾病的诊断、治疗和预防取得了重大进展 [1]。使用纳米策略递送小分子药物可显著改善其不良的理化性质和药代动力学特征，提高药物稳定性，增加药物在靶组织的有效积累和靶向释放。纳米给药系统在临床前实验中得到了广泛的研究，多种高效可靠的纳米递药平台正在逐步实现临床转化。自1995 年以来，美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准了 80 多 种纳米药物的新药研究申请，其中 50 多种被批准上市 [2]。以脂质体、纳米胶束、纳米混悬剂和纳米乳等为代表的注射用纳米给药系统可以到达机体的各个部位发挥作用，故而受到更加广泛的关注。目前，共有 29 种纳米注射剂经美国 FDA 或欧 洲 药 品 管 理 局（European Medicines Agency，EMA）批准用于癌症、贫血、真菌感染、黄斑变性等疾病的治疗和诊断 [3-4]。在全球范围内，纳米注射剂的市场效应不低于新化学实体新药 [5]。国内对纳米注射剂也有着巨大的临床需求，但国产化产品市场占有率过低，加重了社会的医药费用负担，因此迫切需要开发出能够在临床上替代原研药的注射用纳米制剂。

由于纳米药物特殊的物理、化学与生物学性质，其安全性备受关注，研发生产获批门槛高；同时纳米注射剂的生产过程较为复杂，专利仿制技术壁垒难以突破，导致相关产品重现率低，质量难以保证。此外，我国对这类特殊注射剂的研发水平尚处在起步阶段，且缺少相应的指导原则，导致其仿制药的审评监管面临着极大的挑战 [6]。为确保纳米注射剂原研药替代产品的安全、有效和质量可控，明确纳米注射剂仿制药的评价体系和技术要求尤为重要。

1 、纳米注射剂一致性评价相较普通注射剂的特殊之处

注射剂直接注入血管或组织发挥疗效，是临床使用中安全性风险较大的剂型之一 [3]。普通注射剂通常为溶液剂，组成相对简单，其仿制药一般使用与参比制剂相同种类和用量的辅料。而纳米注射剂大多使用新型辅料，组成较为复杂，其仿制制剂所用辅料的组成、用量不仅要与参比制剂相同，微观结构也应与参比制剂保持一致。相较于普通注射剂，纳米注射剂生产过程更加复杂，往往需要使用专有的工艺与设备，生产规模扩大易对产品质量造成影响 [7]，这对纳米注射剂的工艺开发与验证及生产过程中的无菌要求提出了巨大的挑战。纳米制剂与传统药物相比具有独特的组成、粒径、形态和表面性质等，这些制剂特性的微小差异会显著改变主药在体内的吸收、组织分布、消除等，最终影响药品的有效性和安全性 [8]。应当使用精确且重现性良好的检测方法对纳米注射剂的制剂特性进行表征，以确保制剂生产批之间的质量一致性。此外，普通注射剂在体循环中的药物形态与其在作用部位的药物形态高度一致，其仿制药与参比制剂之间的药学等效性即可证明其临床终点一致。而纳米注射剂进入人体后通常需要释放药物进而发挥疗效，体内药物释放的速率和位置可能影响临床疗效和安全性。仅进行体外药学对比研究不足以充分反应纳米注射剂仿制药与参比制剂在药动学行为、临床有效性和安全性方面的差异。

因此，对于纳米注射剂仿制药的一致性评价，应在符合普通注射剂一致性评价总体要求的基础上，同时开展仿制药与上市产品的药学比较研究，并通过临床试验确证其疗效及安全性。

2 、纳米注射剂一致性评价处方工艺研究要点

纳米注射剂的质量受处方工艺影响较大，进而影响制剂在体内的安全性和有效性 [9]。原则上仿制产品的处方应与参比制剂保持一致。纳米制剂中非活性成分组成可能影响药物的释放、吸收与清除等，不仅需要仿制产品所用辅料的种类和用量与参比制剂相同（Q1/Q2 等同），还需要 Q3 即对纳米粒性能至关重要的辅料的物理化学性质一致，例如脂质体仿制产品中脂质的来源，相变行为等需要和原研制剂保持一致 [10]；使用聚合物的仿制产品需要采用合适的技术表征聚合物的分子量、形态、支化度等，以保证其与参比制剂的一致性 [11]。

纳米注射剂生产工艺的微小差异也可能影响药物的体内行为，因此应就乳化、均质、过滤、灭菌等关键生产工艺进行深入研究，尽量保证制造设备和工艺参数与原研药一致。此外，还应保证仿制产品注册批与商业批的生产规模一致 [12]。

3 、纳米注射剂一致性评价质量研究要点

不同的纳米注射剂具有不同的结构和组成，其理化性质和生物学特性也各不相同。在纳米注射剂仿制药的质量研究中，应针对具体品种，使用适当的方法对产品的粒度、形状、释放度、药物晶型、游离药物和结合药物等关键质量属性（critical quality attribute，CQA）进行全面考察，原则上应提供至少 3 批次样品与参比制剂的质量对比考察数据 [12]。大多数纳米注射剂共有的显著影响其理化性质和生物学性能的 CQA 包括但不限于以下类别 [11]：纳米粒的形状、表面电荷和功能化等表面特性、载药量和包封率、药物释放、粒径及其分布等。

3.1 形状

纳米粒形状的改变会引起其血液循环时间、肿瘤或器官靶向性、生物分布等的改变 [13]。纳米粒形状很大程度上决定了纳米粒的体内命运和治疗效果，在纳米药物递送过程中起关键作用。透射电子显微镜、扫描电子显微镜和原子力显微镜可被用来考察纳米粒的形状。使用透射或扫描电镜分析纳米粒形态时需对样品进行干燥处理，此过程会使脂质体或胶束等纳米粒子的成像产生伪影，使用低温冷冻法制备样品可避免这一现象 [14]。原子力显微镜具有纳米级分辨率，能够有效表征纳米粒的形貌特征，可以在大气或真空、常温或低温、溶液、电性等测定条件下对高分子聚合物、金属材料等多种样品进行精确表征。

3.2 表面电荷和功能化等表面特性

纳米粒的表面疏水性和电荷决定了纳米粒之间、纳米粒与生物分子之间的相互作用，因此纳米粒的表面特性对其稳定性、血液循环、生物分布、靶向性等有很大影响 [13，15]。表面电荷通常用zeta 电位来描述，电泳光散射法、可调谐电阻脉冲传感技术等可用来测定 zeta 电位。纳米粒表面聚乙二醇化程度、元素组成等特性可选用合适的质谱或光谱法进行表征 [11]。

3.3 载药量和包封率

载药量和包封率是衡量制备工艺和成本的重要指标。高载药量可使单次注射的纳米药物浓度降低、剂量减少，保证制剂稳定性的同时减少了辅料的使用和潜在毒性。从生产角度来看，高载药量对生产规模的要求更小，更有利于生产过程中的质量控制 [15]。纳米制剂中的游离药物的体内过程不同于包封药物，可能导致严重的毒副作用。高包封率对纳米制剂提高药物疗效、降低药物不良反应有重要意义。测定载药量和包封率的关键是采用合适的方法分离游离药物与包载药物，常用的方法包括凝胶色谱法、透析法、离心法等。

3.4 药物释放

纳米注射剂所使用的功能性辅料的性质，如磷脂的相变温度、聚合物的分子量、结晶度、疏水性以及生产工艺的差异，均会影响其释药行为，进而影响制剂的药动学行为、疗效及安全性 [15-16]。纳米注射剂的体外释放试验通常从透析膜法、流通池法、样品分离法、连续流动法、弗朗茨扩散池法等体外释放测试方法中选择合适的方法进行研究 [17-18]。但由于生物环境较为复杂，体外测试难以重现实际的体内环境，体外释放试验结果无法准确反映药物在体内的释放情况。因此，在考察药物体外释放度的同时，应建立相关的体内药动学试验，这对产品的质量控制、生产工艺优化以及生物等效性研究意义重大 [18]。

3.5 粒径及其分布

粒径作为纳米药物最直观的基本属性，其大小与制剂的载药量、药物释放和生物学性能密切相关 [19-20]。粒径的微小差异会对药物的释放速率、纳米粒在血液循环中的半衰期，清除途径及靶向积累等造成显著影响，进而影响纳米制剂的安全性和疗效 [15]。粒径分布或多分散性决定了纳米粒性能的均一性。

3.5.1 粒径及其分布的表征方法

相较于传统药物，纳米制剂具有独特的粒径范围，其生产和监管面临着巨大的挑战。粒径及其分布作为纳米制剂的 CQA，对纳米制剂的安全性和疗效至关重要 [21]。应系统地研究纳米制剂的粒径、多分散性、截止粒径限度等对药物性能和质量的影响，并确定与最终产品质量相关的粒径表征参数 [22]。此外，纳米材料的粒径分析方法众多，所采用的分析原理各异，应根据被测体系、测量精度和准确度等，选择适当的分析方法。

FDA 药品审评与研究中心（center for drug evaluation and research，CDER）批准的纳米制剂多采用散射技术测定粒径。其中，动态光散射（dynamic light scattering，DLS）法操作简便快速，具有相对廉价、样品可回收等特点 [23]，被广泛用于纳米粒的粒径表征。此外，还可以使用激光衍射法和显微镜法，使用显微镜法（如原子力显微镜、低温透射电子显微镜等）不仅可以进行定性或半定性的图像分析，还能进行定量研究（例如测定粒度分布等）[24]。提交给 CDER 的产品文件中对粒径和粒径分布数值的表示方法也有很大差别 [24]。大部分产品使用平均值或 D10/D50/ D90 来表征粒径（D50 指 50% 样品的粒径≤ D50 数值，D10、D90 以此类推 [25]），一些纳米混悬剂使用截止粒径限度（规定粒径的上限或下限）来评价粒径 [26]。

纳米制剂的粒径通常由流体动力学半径（hydrodynamic radius，Rh）定义，但由于 Rh 测量的前提是将测量对象假设为实心球体，仅测定 Rh 并不能对所有纳米粒的粒径进行全面表征，例如，在装载药物之前为中空状态的脂质体和一些棒状或圆盘状的纳米粒 [11]。对这些非实心球体纳米粒的粒径表征有必要测定其回转半径（radius of gyration，Rg），即纳米粒表面微分质量的集中点到粒子核心的加权平均距离，以对纳米粒的大小和形状进行准确表征 [11]。Rg 可以通过光散射、X 射线小角散射和中子小角散射等方法测定 [27]。

3.5.2 粒径及其分布的群体生物等效性研究

纳米制剂的粒度可以影响药物的组织分布和清除 [28]，造成血药浓度与靶组织的药物浓度不同步，此时经典药动学研究不足以评价纳米制剂的生物等效性。FDA 针对盐酸多柔比星脂质体注射剂 [10]、紫杉醇纳米注射剂 [29] 等发布的仿制药指导原则中明确规定，在工艺研究阶段，应对这类特殊注射剂的粒径大小和分布进行体外群体生物等效性（population bioequivalence，PBE）考察，以评价仿制产品是否比参比制剂更具多变性 [30]。

FDA 提出用混合标度法比较仿制药与参比制剂的体外 PBE，假设受试制剂（test product，TP）和参比制剂（reference product，RP）等效，则有 [30-31]：

上述公式中 average BE limit 代表生物利用度界限值；ε p 为方差因素，FDA 指导原则中指出ε p 与σ T0 的数值有待针对具体制剂进一步研究确定。

根据相关法规文献 [6，30-31]，结合制剂自身的特点确定样本量，进行与制剂 CQA 相关的体外试验研究，对得到的试验数据使用公式 1 或公式2 进行统计学检验（即计算不等式左侧 95% 置信区间的上限值），小于 0 即有 95% 的把握说明 TP与 RP 是等效的。除了满足置信区间的限度，为排除 TP 与 RP 不等效的假阳性结果，TP 与 RP 的点估计比值应该在 0.9 ～ 1.11（包括边界值）[6]。

目前 FDA 公布的纳米注射剂仿制药指导原则中选择 D10，D50，D90，span [D10，D50，D90 无 法充分描述粒径分布，常用 span 对其量化，span ＝ （D90 － D10 ）/D50[25]] 或多分散系数作为 PBE 的主要考察参数。在体外使用 PBE 方法考察对制剂药动学影响较大的 CQA，结合药动学指标和临床终点指标能够更加全面地评价制剂的疗效和毒性，以缩短药物研发周期，降低研发风险。在实际应用中，还可根据上述方法预测粒径的等效范围，以指导仿制纳米制剂的处方设计和制备工艺优化，在研发阶段即可对药品质量加以控制 [6]。因此，建议针对具体产品选择合适的粒径及其分布表征技术并对相应测定参数进行 PBE 研究。

全面表征纳米注射剂的 CQA，有利于在研发和生产过程中制订并实施过程控制策略，有效规避纳米注射剂仿制药研发过程中粒度不合理、包封不完全、辅料不稳定、药物突释等带来的潜在风险 [2，16]，确保仿制产品的安全性和有效性。

4 、结语

从 FDA、EMA 等批准上市的产品来看，各国药监部门对其仿制药的研究大多基于渐进式的原则。在仿制产品的研发和监管过程中，首先保证其同参比制剂的药学一致性。纳米注射剂仿制产品研发过程中的药学技术要求主要包括：① 处方及生产工艺原则上应与参比制剂保持一致；②对纳米注射剂的粒径及其分布、形状、表面特性、包封率 / 载药量、体外释放等 CQA 进行全面精确的表征。粒径及其分布对纳米注射剂生物学特性影响较大，其微小变化可能改变给药后血液循环中纳米制剂的表面属性等理化性质，显著影响纳米粒的稳定性、体内分布和药物释放 [25]，即使纳米注射剂仿制药与原研产品的血药浓度相似也不足以说明两者的生物等效性。因此，有必要对粒径和粒径分布的相关参数进行 PBE 研究，以补充药动学指标作为纳米注射剂仿制药体内生物等效性评价标准的不足 [32]。此外，对粒径及其分布进行 PBE 研究对纳米制剂的处方工艺优化也有指导意义。在纳米注射剂仿制药与参比制剂药学一致的基础上，需要以药动学对比研究为主线进行非临床研究，以充分提示仿制产品与参比制剂在药物释放、组织分布、药效和毒性上的一致性，必要时应开展随机对照临床试验研究。

对生产工艺过程和工艺参数研究不全面、缺少对纳米注射剂 CQA 表征参数的说明与规范以及纳米注射剂 CQA 表征方法选择不当等问题使得纳米注射剂一致性评价进展缓慢 [33-34]。目前我国正在进行一致性评价的纳米注射剂有注射用紫杉醇（白蛋白结合型）、伊立替康脂质体、盐酸多柔比星脂质体、注射用两性霉素 B 脂质体、蔗糖铁注射液、右旋糖酐铁注射液等品种，仅有注射用紫杉醇（白蛋白结合型）通过了一致性评价。对纳米注射剂仿制药的药学技术要求进行深入研究有利于开展临床前及临床研究、缩短仿制产品审评周期以及控制制剂生产过程中的质量，同时为制订适合我国纳米注射剂仿制药一致性评价的指导原则提供参考，以提高我国对纳米注射剂仿制药的研发和监管决策能力。