1.问题描述

1.1 含量测定中，对照品主峰与样品主峰RT值无法完全重合；

1.2 检测限1.3%，灵敏度达不到要求（要求定量限≤0.2%）

2.原分析方法参数与图谱

2.1 原方法参数

2.2 典型图谱

3.原因分析

3.1 波长过低，在线混合，导致基线噪音大，含量1.30%才能达到LOD水平；

3.2 进样量4μL，HPLC中，一般杂质外标的含量不低于5μL；

3.3 样品溶液呈酸性（原配样方式直接用乙腈稀释），磷酸缓冲盐pH4.5左右，无缓冲能力；

3.4 在线混合，HILIC色谱柱平衡时间很长，若无梯度要求，应预混好流动相。

4.方法优化

4.1 优化样品前处理方式

样品配制方法：样品溶液称取规定量于容量瓶中，先用三乙胺调节pH至6-7，再用乙腈稀释至容量瓶刻度线。

原方法参数进此溶液得到和上述一样的图谱，对照品主峰还是不能与样品主峰完全重合。

4.2 优化方法参数

4.3 优化图谱

4.4实验结果

（1）提高波长至205nm；预混流动相；提高进样量至5μL；这三种方式，提高了方法的灵敏度。经预验证后，LOQ限度为0.083%，大大提高了方法的灵敏度。

（2）使用5mM磷酸二氢钾+5mM磷酸氢二钾的缓冲液，提高了方法的缓冲能力，样品溶液和标准溶液RT值能完全重现。

5.总结

5.1 灵敏度计算公式S/N=2H/noise,所以灵敏度不完全取决于峰高，要综合比对峰高和噪音，选取合适的波长；

5.2 样品过酸或者过碱，可能会导致RT重现性较差，可通过提升缓冲液的缓冲能力去解决（缓冲液pH与样品溶液的pka需相差1.5以上）。

以下是部分缓冲液的缓冲范围

5.3 若是无梯度变化，可预混流动相，规避在线混合产生气泡导致RT漂移的情况发生；