第一法 金黄色葡萄球菌定性检验

1、7.5%氯化钠肉汤增菌培养：

 （1）若样品本身在均质后清澈，培养18h观察呈现一定程度的浑浊（与培养前相比），则接种平板；若18h后仍无变化，继续培养至24h后无论浑浊与否都接种至平板；

 （2）若样品本身在均质后浑浊，则直接培养至24h后再接种平板。

2、血平板：

  36±1℃培养18h后观察，若有菌落生长或有菌落生长的迹象（无论是否溶血），则应酌情配制NA、BHI并分装至小试管中（NA 10mL/管、BHI 5mL/管）、灭菌后NA应斜放凝固成琼脂斜面备用。至血平板培养至24h取出，挑取菌落进行革兰氏染色镜检，同时挑取菌落接种至NA斜面、BHI肉汤管，36±1℃培养24h。

3、接种原则：

 （1）革兰氏染色后还剩余10个或10个以上菌落，则NA、BHI分别接种5管；

 （2）若多于5个（不包括5个）不足10个，则BHI接种5管，剩余的接种NA；

 （3）5个及以下则全部接种BHI，不接种NA。

4、BP平板：

  36±1℃培养24h后观察，有菌落生长则取出，无菌落生长则继续培养至48h后再观察。若血平板已挑取菌落进行证实试验，则不必再挑取BP平板上的菌落进行实验。若血平板上无菌落生长，则应在24h～48h内逐步观察BP平板是否长菌或有无长菌迹象，有则需配置BHI及NA，挑取BP上的菌落进行纯化、增菌，36±1℃培养24h。 

5、血浆凝固酶试验：

 （1）根据BHI管数，取冻干血浆粉，每瓶用移液枪加入0.5mL生理盐水，使其充分溶解，再换移液枪枪头取0.3mLBHI培养物加入其中（每管BHI用1个枪头），振荡摇匀后于36±1℃培养，计时，每30min观察一次，如呈现凝固（将试管倾斜或倒置时出现凝块）或半凝固（一般的液体呈现凝固）则判定为阳性。若一直不凝固，则一直观察，直至观察至6h（查看12次）还未凝固，则试验终止，判定为阴性结果；若中途出现完全凝固或半凝固，则试验终止，判定为阳性结果。

 （2）同时取金黄色葡萄球菌标准菌株（ATCC 6538以及CMCC（B）26003各一支）制成菌悬液后作为阳性对照、以灭菌生理盐水为阴性对照，分别接种至BHI中同步培养后进行血浆凝固酶试验。

 （3）若血浆凝固酶试验结果可疑，则挑取NA上的菌落接种BHI再次进行试验。

 第二法 金黄色葡萄球菌平板计数法

 1、取1mL样品稀释匀液接种3个BP平板（此处并未严格按照标准中0.3mL、0.3mL、0.4mL精确取样，由于如此操作会增加试验时间，无法在15min内完成试验）。

 2、涂布时不要触及平板边缘（会导致样液涂抹不均匀，大部分汇集于边缘）。

 3、可用同一根涂布棒从低稀释度到高稀释度进行涂布（不用换涂布棒）。

 4、涂布完成后应稍微放置一段时间使培养基吸收样品匀液。

 5、若水珠较多，可正置于培养箱中1～2h后再倒置培养。

 6、36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

 第三法 金黄色葡萄球菌MPN计数法

 1、样品稀释同菌落总数，取3个连续稀释度稀释液（或包括液体样品原液），每个稀释度接种3管7.5%氯化钠肉汤，每管接种1mL，36±1℃培养18h后观察，若出现浑浊则接种至BP平板，若无变化则继续培养至24h后再接种至BP平板。

 2、划线接种至BP平板，36±1℃培养24h后观察，有典型菌落生长则进行证实试验（革兰氏染色镜检、血浆凝固酶试验、划线血平板）。若无菌落生长则继续培养至48h后再观察，有典型菌落生长则进行证实试验，无典型菌落生长则试验终止。

 3、根据证实后的阳性管数差MPN表得出结果。

 GB 4789.4-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验

（标准补充）

 1、称取25g样品于可封口的均质袋中，再倒入BPW至250g，尽量排去均质袋中的空气后再封口、均质后直接置于36±1℃培养箱中培养过夜（标准要求为8～18h，一般培养过夜后第二天早晨继续下一步试验）

 2、TTB、SC应酌情配制，现配现用，不宜久置。若BPW放入培养箱的当日时间允许，则可将TTB、SC灭菌、配制、分装后冷藏以备第二天实验；若当日时间不允许，则次日早晨灭菌、分装，下午即可转接培养。

 3、TTB：灭菌条件为121℃15min，与一般试验耗材、培养基的灭菌条件一致，故在灭菌时可考虑同时灭为一锅。且须同时灭一些带塞（可带塑料盖子）的小试管、10mL移液枪枪头、1mL移液枪枪头，在灭菌完成后温度降至不烫手时，轻轻晃动三角烧瓶使底部白色沉淀物浮起而充分混匀，每100mLTTB中加入1支碘液（陆桥，P-72）、1支0.1%煌绿（陆桥，P-73），充分摇匀至整瓶TTB呈现绿色，此时用移液枪准确吸取10mLTTB至已灭菌的小试管中，盖上盖子。取1mLBPW增菌液至1管TTB中，于42℃培养18～24h（若时间允许、或18h后观察试管仍无浑浊，则培养至24h，否则培养至18h即可）。

 4、SC：仅需加热煮沸灭菌（因SC易溶于水，煮沸即可，无需过度加热），冷却至不烫手时用移液枪吸取10mL分装至已灭菌的小试管中，盖上盖子。取1mLBPW增菌液至1管SC中，于36±1℃培养18～24h（若时间允许、或18h后观察试管仍无浑浊，则培养至24h，否则培养至18h即可）。

 5、BS、XLD应酌情配制，在用前一天配制后备用（两者仅需加热灭菌、不添加任何添加剂，无需过度加热）。BS在不烫手时即可倒成平板，否则容易沉淀或凝固，且在倒平板前应充分摇匀以防止有效成分沉淀于底部（棕色或棕黄色颗粒物）。XLD过度加热会造成琼脂不易凝固、划线时容易划破，甚至不凝结成块、无法倒置。

 6、XLD培养条件：36±1℃培养18～24h。18h后观察，若TTB、SC增菌液都有菌落生长，则可挑取任意生长良好的菌落进行生化鉴定试验；若只有其中一种增菌液有菌落生长、或两者都无菌落生长，则继续培养至24h再观察，此时无论菌落生长与否都不再继续培养，只要其中任一增菌液有典型或可疑沙门氏菌生长则挑取进行生化试验。

 7、生化鉴定：

 （1）一般情况下，XLD上的任一增菌液长菌，则BS上对应增菌液也会长菌，此时若已挑取XLD上的菌落进行生化试验，则无需挑取BS上的菌落；或XLD上的两种增菌液长了形态特征完全相同的菌落，则挑取任一典型菌落进行生化鉴定即可，且无论BS上菌落生长如何，都不再挑取BS上的菌落进行生化试验。

 （2）若出现XLD未长菌的增菌液在BS上长菌，则还需挑取BS上的该菌落进行生化试验。

 （3）用生化鉴定试剂盒进行生化鉴定，依据产品说明书判断阴性或阳性，再根据标准中表2～表5的内容逐步进行判定（即生化鉴定试剂盒是将标准中的所有鉴定步骤同时完成，但判定时依然要按照标准逐步判定，只要其中任一阶段可判定为非沙门氏菌属，则不再往下判定，鉴定试验即终止）

 （4）若判定为沙门氏菌属，则可选择进行或不进行血清凝集试验。首先应确定该菌落无自凝性，否则无法进行血清学试验。