近年来，多重耐药和泛耐药病原菌不断产生，新的抗菌药物研发速度已无法满足临床治疗需求。磷霉素和多黏菌素等抗菌药物被重新用于临床抗感染治疗。磷霉素对革兰阳性菌和革兰阴性菌有独特的作用机制，不易产生交叉耐药，仍有较好的临床应用价值。文章对磷霉素的耐药机制，如murA发生突变引起的磷霉素耐药、膜转运体的结构基因突变、质粒介导的磷霉素修饰酶，以及异质性耐药等耐药机制进行综述。
随着各类抗菌药物的广泛使用，病原菌在耐药性增强的同时，也不断产生新的耐药机制。磷霉素是一种广谱抗菌药物，对革兰阳性菌和革兰阴性菌有独特的作用机制，不易产生交叉耐药，其毒性低，组织（甚至在中枢神经系统和骨骼）渗透性高。磷霉素对耐药革兰阳性菌，如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、万古霉素耐药肠球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）和青霉素耐药肺炎链球菌（penicillin-resistant Streptococcus pneumoniae，PRSP），以及耐药革兰阴性菌，如产超广谱β -内酰胺酶（extended-spectrum betalactamase，ESBL）和产碳青霉烯酶肠杆菌科细菌都具有良好的抗菌活性。但是，随着磷霉素的使用，其耐药率也明显上升，磷霉素耐药机制的相关报道也逐渐增多，包括染色体上磷霉素靶酶编码基因发生突变、膜转运体的结构基因突变、质粒介导的磷霉素修饰酶及异质性耐药。本文对磷霉素耐药机制的最新研究进行综述。
1、murA基因突变导致的磷霉素耐药
磷霉素的作用靶酶UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇丙酮酸转移酶MurA是催化肽聚糖合成第1步反应的关键酶之一，主要作用是催化UDP-N-乙酰葡萄糖胺和磷酸烯醇丙酮酸转化为UDP-N-乙酰葡萄糖胞壁酸。磷霉素通过抑制MurA来阻碍细胞壁的合成。murA基因突变导致磷霉素靶酶MurA发生氨基酸替换是导致磷霉素耐药的重要因素。有些细菌天然对磷霉素有耐药性，导致天冬氨酸取代了半胱氨酸的murA突变使病原体（衣原体、结核分枝杆菌和费氏弧菌）对这种抗菌药物产生天然耐药性。同样，在MurA基因117位点的半胱氨酸替代天冬氨酸后，结核分枝杆菌对磷霉素开始敏感。
革兰阳性菌和革兰阴性菌临床分离株中都存在murA基因突变导致的获得性耐药。磷霉素耐药肠球菌发生磷霉素靶酶MurA突变的概率较大，以MurA上Cys263Arg、Ser281Gly的氨基酸替代最常见，部分菌株MurA发生了Cys263Arg、Glu278Arg、Ser281Gly和Val283Ile等多个氨基酸替代，相应的磷霉素最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）也较高。这些氨基酸替换可能是肠球菌对磷霉素耐药的机制，我国台湾地区的一项抗菌药物耐药性监测研究在MRSA中也发现了murA突变，该研究在这些突变基因中鉴定出7个不同亚型，只有1个亚型导致了717位点的1个核酸缺失，而其他6个突变导致了MurA蛋白中不同的氨基酸替换。最常见的对磷霉素耐药的murA突变体是I型G257D突变。有学者在磷霉素耐药大肠埃希菌和碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌中都检测到了murA基因突变。murA基因突变是临床病原菌磷霉素耐药的重要机制之一。
2、转运蛋白突变、缺失导致的磷霉素耐药
细菌膜通透性改变可抑制抗菌药物进入细菌内部，而降低抗菌药物的杀菌或抑菌作用，细菌表现为对该药物耐药。膜通透性改变也是引起磷霉素耐药的重要原因之一，最常见的膜转运体突变是编码GlpT和UhpT膜转运体的结构基因突变。临床常见细菌通过GlpT和UhpT膜转运体运输细菌代谢功能和毒力所需的甘油和其他碳水化合物，磷霉素通过相同的转运体进入细菌内部。编码GlpT和UhpT膜转运体的结构基因、GlpT和UhpT的调节基因，调节cAMP水平，进而降低GlpT表达的ptsI和cyaA基因，以及影响细菌生长和细胞壁通透性的abrp基因发生突变均可以导致细菌对磷霉素的摄取降低，导致细菌对磷霉素产生耐药。
glpT和uhpT的突变是引起大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌磷霉素耐药的主要原因之一。LEE等发现，在磷霉素耐药的MRSA中包含6种不同glpT基因的突变，每种突变都会导致GlpT蛋白内的氨基酸替换；此外，他们还在uhpT基因中发现了4种不同的突变，均可导致UhpT蛋白的氨基酸替换。有研究发现，金黄色葡萄球菌磷霉素耐药主要由glpT和uhpT突变引起；同时，外排基因tet38的过表达也是引起磷霉素耐药的重要原因。
SORLOZANO-PUERTO等发现，在29株大肠埃希菌中，有22株因uhpT和/或uhpA基因缺失而对磷霉素产生耐药性。碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌的glpT突变（或glpT缺失）和/或uhpT突变也是磷霉素耐药的机制之一。有学者在大肠埃希菌中发现了对磷霉素耐药的新的染色体uhpB或uhpC基因突变，通过定点诱变技术引入突变uhpB（G469R）或uhpC（F384L）可使大肠埃希菌（CFT073）（MIC=1 mg/L）磷霉素MIC升高128倍。
3、磷霉素修饰酶导致的磷霉素耐药
临床主要致病菌对磷霉素耐药的重要机制之一是获得质粒编码的金属酶基因。Fos酶属于乙二醛酶超家族，包括FosA、FosB、FosC、FosL1-2和FosX，这些金属酶通过添加谷胱甘肽（FosA1～A10，FosL1-2，FosC2）、杆菌硫醇（FosB）或水（fosX）来催化磷霉素环氧化物（环氧烷）环的打开，使磷霉素失活。近十年来，至少有10种fos基因被发现，其中fosA、fosA亚型和fosC2主要见于肠杆菌科细菌；除fosA2外，所有fosA亚型都在质粒和转座子、邻近的插入序列元件或整合子中被发现，表明这些可移动元件在肠杆菌科细菌质粒介导的fos基因转移中起着重要作用。
3.1 FosA修饰酶及亚群
fosA及亚群基因结构很相似（fosA1～A10），fosA2基因与fosA具有95%的氨基酸同源性；fosA3和fosA5是碳青霉烯类耐药及产KPC酶肺炎克雷伯菌磷霉素耐药的主要机制，分别有约90%和10%菌株携带fosA3和fosA5基因，并可通过质粒在医院内广泛传播。fosA4基因于2014年在日本的1株大肠埃希菌临床分离株中被鉴定出来，澳大利亚有报道称在分离自尿路感染患者的大肠埃希菌中也检测到质粒编码的fosA4基因，其对磷霉素的MIC>256 mg/L。fosA5基因全长420 bp，编码1个含有139个氨基酸的蛋白质，与fosA、fosA2、fosA3和fosA4的同源性为69%～80%，携带fosA3、fosA4和fosA6基因是大肠埃希菌磷霉素耐药的机制之一。
有研究在分离自尿液样本的大肠埃希菌中发现了质粒编码fosA8 ， 与Leclercia adecarboxylata染色体中的fosA基因一致性最高这种菌引起的人类感染罕见，原因可能是由于高水平的fosA基因表达对磷霉素具有固有耐药性。FosA9首次在一个反复发作的脓毒症患者血培养分离的大肠埃希菌中被检出。fosA2和fosA7分别为阴沟肠杆菌和Salmonella enterica serovar Heidelberg中fosA的染色体变异，被提议命名为FosAEC和FosASH。
除本身存在fosA可引起耐药外，某些启动子对其表达的影响也对磷霉素耐药起重要作用。有学者对磷霉素耐药并产生碳青霉烯酶（OXA-48）的肺炎克雷伯菌进行了全基因组测序，结果显示，ISEcp1-bla CTX-M-14b串联插入染色体编码的lysR-fosA位点上游；他们对lysR和fosA基因表达量进行定量分析，发现该插入有1个强大的杂交启动子，使fosA基因过表达，导致磷霉素耐药。
3.2 FosB修饰酶
FosB是一种Mg2+依赖酶，以L-半胱氨酸作为硫基供体，催化L-半胱氨酸或杆菌巯基添加到磷霉素上，使磷霉素失去杀菌活性。FosB型酶主要存在于芽孢杆菌和葡萄球菌中，在肠球菌中也有报道，1项关于磷霉素耐药屎肠球菌fos基因的研究结果显示，在145株屎肠球菌中，有10株对磷霉素耐药（MIC>1 024 mg/L），且均携带fosB3基因，部分菌株fosB3位于转座子Tn1546，提示fosB3对屎肠球菌的磷霉素耐药起重要作用。
3.3 FosC、FosX和FosL修饰酶
在Pseudomonas syringae中发现的FosC是一种类似于谷胱甘肽s转移酶的酶，它能在ATP的参与下因催化磷霉素磷酸化而失活。FosX是一种Mn2+依赖水解酶，与其他Fos酶作用相似，通过在磷霉素的C1位置加水并打开其环氧环，使磷霉素失去活性。最新的研究结果显示，FosX的高表达是肠球菌磷霉素耐药的重要原因之一，在单核李斯特菌、鲍曼不动杆菌的磷霉素耐药中也起重要作用。有学者在快速生长的脓肿分枝杆菌亚群中发现了FosM，其为FosX亚家族的成员，含有134个氨基酸，是一种依赖于Mn2+的FosX型水合酶，对MSH或其他硫醇没有选择性。KHABTHANI等从人类肠道的新细菌物种（Bacillus massiliogabonensis、Gracilibacillus timonensis和Bacillus phoceensis）中鉴定出3个新的磷霉素耐药基因，分别是fosM1、fosM2和fosM3，均对磷霉素产生高水平的耐药；他们认为，人类微生物群中的细菌可能是磷霉素耐药基因的储备库。2020年，瑞士有学者发现1株产超广谱β-内酰胺酶的磷霉素耐药大肠埃希菌，携带1个新的质粒介导的磷霉素耐药基因，将其命名为fosL1。有研究发现，FosL1蛋白是一种谷胱甘肽s转移酶，对磷霉素高水平耐药，与其他fosA类家族成员有57%～63%的同源性；该研究在肠道沙门菌基因组中发现了另一个编码FosL1-like酶的基因，这个酶被命名为FosL2，与FosL1具有96%的氨基酸同源性。
3.4 FomA和FomB型激酶
有学者在磷霉素耐药的链霉菌属中发现了1种激酶，该种激酶不同于Fos金属酶，可以修饰磷霉素，并使其毒性消失；这些酶分别由fomA和fomB基因编码，并通过磷酸化使磷霉素失活，FomA将磷霉素转化为一磷酸磷霉素，而FomB则以一磷酸磷霉素作为底物，转化成二磷酸磷霉素。
4、磷霉素的异质性耐药
抗菌药物的异质性耐药是指同一克隆菌株中包含与主要细菌群体相比对抗菌药物敏感性降低的亚群，细菌的异质性可能会出现2种情况：一种是细菌主要群体和异质性的细菌亚群的MIC都在敏感或耐药的范围内，但存在差异；还有一种是细菌主要群体的MIC为敏感，而异质性的细菌亚群为耐药。
有研究发现，当从磷霉素异质性耐药的肺炎链球菌中敲除murA1后，磷霉素异质性耐药也随之消失了；进一步的研究结果显示，murA1是磷霉素的异质性耐药所必需的，但并不是唯一的相关因素。磷霉素异质性耐药表型的发生和变化部分是由菌株的突变增加导致的，因此，不仅在磷霉素药物敏感性试验中，在其他抗菌药物的药物敏感性试验中，都应考虑这些异质性耐药亚群体。
5、总结与展望
磷霉素由于抑菌作用机制独特而具有广谱抗菌活性，对金黄色葡萄球菌和肠球菌等革兰阳性菌、大部分肠杆菌科细菌和非发酵菌均有良好的抗菌效果。随着临床上多重耐药菌的播散，以及有效抗菌药物的缺乏，磷霉素的优点日益凸显，其耐药情况也受到越来越多的关注。磷霉素的耐药机制包括murA基因突变、转运蛋白突变和缺失、磷霉素修饰酶以及异质性耐药。随着磷霉素在临床被越来越多地重新应用，以及蛋白组学、全基因组测序等检测技术的不断成熟，在未来可能会发现更多新的耐药基因和耐药相关基因突变，我们也会持续关注相关研究。
