答:SDA不是选择性培养基,而是一种广谱的增菌培养基,pH范围5.4-5.8,某些细菌是可以在SDA上生长的,霉菌和酵母菌总数计数时SDA上生长的菌均应计入霉菌和酵母菌总数;或者可以经过评估选择含有抗生素(如氯霉素)的SDA或者玫瑰红钠琼脂培养基进行霉菌和酵母菌总数计数。
问:琼脂培养基为什么需要倒置培养?
答:在进行微生物培养时,若正置培养,琼脂培养基中的水分易蒸发使平板干裂,不利于微生物的生长;同时水蒸汽会在平皿盖上形成冷凝水,若回落在培养基表面,会使菌落蔓延生长,无法计数,若冷凝水太多会使培养基与平皿分离,容易滑动倒置培养可减少培养基表面的空气流动,减慢培养基中水分蒸发的速度,充分维持弹性,有利于菌株的生长和繁殖,防止空气中杂菌对培养基及培养物造成污染;也会由于重力作用在一定程度上使营养物质沉积到培养基表面,有利于微生物利用营养物质;倒置的平板方便拿取,避免环境中杂菌的污染。中国药典2015版1105中关于平皿法(倾注法)有明确要求。
需要注意的是,《食品安全国家标准 食品微生物学检验霉菌和酵母计数》(GB4789.15-2016)是要求正置培养,而非倒置,以防霉菌孢子形成次生菌落,影响计数结果。
问:中国药典2015版要求霉菌和酵母菌平皿计数时培养5-7天,那么培养5天可以么?
答:微生物限度检查中霉菌和酵母菌培养时间5-7天,因不同的霉菌酵母菌生长特性不同,所以具体培养时间,由企业根据各自情况(基于风险评估)自行确定。
问:中国药典2015版要求霉菌和酵母菌平皿计数时培养5-7天,该如何计数?
答:但是在实际操作中,我们会发现如果样品中存在霉菌,培养到第5-7天时,可能菌落之间已经融合,并蔓延生长至整个平皿,此时的霉菌已经无法计数。建议霉菌和酵母菌检测时,第三天计一次数,培养结束时计一次数,比较两组数据,以多者为最终结果。
霉菌和酵母菌检测培养过程中,避免频繁取拿观察,尽量避免振动等,防止孢子扩散。
问:药企的环境检测应该依据那个标准?
答:关于环境检测,2015版《中国药典》的9205和GB/T16294-2010《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》都有规定,且一些细节略有差别。其中国标的规定更为具体,建议实际操作中以国标为准,药典可以做为参考。
问:一些不常用的培养基开瓶后在效期内较长时间没有用完,那么这些开瓶后的培养基需要进行复验吗?
答:开瓶后的培养基,如果长时间不使用,还在效期内,建议开瓶后间隔1年进行复验。如果出现结块,则不能使用。同理,如果同一批次一次购买量较多,一年内未使用完,也建议进行复检。
问:薄膜过滤法,滤膜边缘长了一圈菌,原因有哪些?
答:出现这个现象,可能的原因(常见)包括以下三个方面:
(1)滤杯:无论是一次性的滤杯还是反复灭菌的滤杯,理论上都是无菌的,但是不排除滤杯灭菌不彻底和使用时操作人员与滤杯底部接触,污染滤杯的可能。
(2)微限仪的滤头:微限仪滤头如果在更换滤膜的过程中灭菌不彻底,上一个样品可能会污染下一批滤膜,如果微限仪长时间不灭菌,或使用的滤膜破损,都可能使微限仪内部管道带菌,在泵开启的瞬间形成气溶胶,污染滤头。
(3)转移过程中被污染:在滤膜由滤头转移至平皿的过程中,镊子灭菌不彻底,操作者手不稳使滤膜和仪器,台面,平皿,身体发生过接触。
具体问题具体分析,如果出现这样的问题,需要根据实验室的实际情况具体分析。
问:控制菌检查法中用到的培养基,在做培养基适用性的时候,其中有“指示特性”的表述,那么“指示特性”是指的什么意思?
答:培养基指示特性包括菌落大小、形态特征、指示剂反应情况(菌落颜色变化)等。例如大肠埃希氏菌在麦康凯琼脂培养基上桃红色菌落有沉淀环、乙型副伤寒沙门菌在XLD有黑心等。
问:无菌检查法用到的培养基(FTM和TSB)进行培养基适用性检查的时候需不需要使用对照培养基?
答:在2015版《中国药典》无菌检查法通则1101中,并没有强制规定灵敏度检查需要使用对照培养基,所以不使用对照培养基也是可以的。但是国家有FTM和TSB的对照培养基,建议在做FTM和TSB的培养基适用性时,使用对照培养基进行参比。
问:生孢梭菌如何计数?
答:(1)使用用硫乙醇酸盐流体培养基,在培养16-18小时这个时间进行观察,计数,计数前不要摇晃,培养时间太长,培养基将浑浊,点计不清;
(2) 使用哥伦比亚琼脂培养基,浇注或涂布后,置厌氧罐(袋)里,再置培养箱培养,计数。
问:无菌检查法中,为什么培养基灵敏度检查用了铜绿假单胞菌,而方法适用性以大肠埃希菌为验证菌株?
答:我国是抗生素及注射剂生产使用大国,铜绿假单胞菌为假单胞菌属菌种,对很多抗生素都天然耐药,药物敏感度不高,不适合做方法适用性。但假单胞菌属的细菌对培养体系的营养要求高,所以适合做培养基适用性检查。
问:什么是不可接受微生物?
答:不可接受微生物通常是指那些已知有明显致病性的,存在足够的数量,通过产品的给药途径可能导致患者不可接受风险的微生物。如何确定一种微生物是不可接受的,需要进行风险分析,包括微生物负载量、微生物特性、产品特性、给药途径、对患者潜在影响等。
问: 培养基灭菌没有按照厂家提供的灭菌参数进行,是否可行?
答:可以。厂家产品说明书提供的灭菌参数可作为参考使用,使用单位也可以根据自己实验室的实际情况,在相关法规要求内,使用自己验证过的灭菌参数来执行。
【法规来源:中国药典2015版9203药品微生物实验室质量管理指导原则 ……培养基灭菌应按照生产商提供或使用者验证的参数进行……】
问:草酸钾兔血浆和兔血浆的用途分别是什么?
答:草酸钾兔血浆用于溶血性链球菌链激酶试验,致病性乙型溶血性链球菌能产生链激酶(即溶纤维蛋白酶),此酶能激活正常人体血液中的血浆蛋白酶原,使生成血浆蛋白酶,而后溶解纤维蛋白。此实验乙型溶血性链球菌阳性,金黄色葡萄球菌阴性。
兔血浆用于金黄色葡萄球菌的血浆凝固酶试验。细菌生成血浆凝固酶后释放于血浆中,称为游离凝固酶,不直接作用到血浆纤维蛋白原上,而是被血浆中的致活剂(即凝固酶致活因子)激活后变成耐热的凝固酶样物质,此物质纤维蛋白原变为固态纤维蛋白,血浆因而凝固。致病性葡萄球菌能产生凝固酶,例金黄色葡萄球菌阳性,表皮葡萄球菌阴性。
问:革兰氏染色有哪些注意事项?
答:(1)最好挑选18-24h的菌落进行革兰氏染色,培养时间过久的的革兰氏阳性细菌可能会被染成红色而造成假阴性。
(2)挑取适量的菌,不宜过多,均匀涂开。
(3)乙醇脱色是革兰氏染色是否成功的关键,15-30s为宜,脱色不够可能会造成假阳性,脱色过度可能会造成假阴性。
问:如何根据实验需要制备斜面?
答:根据实验需求,摆放斜面一般有三种形式:
(1)长斜面:斜面底部刚覆盖试管底部,上部距管口2.5-3cm左右;例如TSA传代斜面。
(2)高层斜面:斜面与底层高度约为2:3,即底部高约3cm,斜面长度约2cm;如三糖铁高层斜面。
(3)普通斜面:斜面底部距试管底部约1cm,上部距管口约2.5-3cm。
问:三糖铁培养基颜色变化原理是什么?
答:该培养基含有乳糖、蔗糖和葡萄糖的比例为10:10:1,只能利用葡萄糖的细菌,分解葡萄糖产酸可使斜面先变黄,但因量少,生成的少量酸接触空气而氧化,加之细菌利用培养基中含氮物质,生成碱性产物,故使斜面后来又变红,底部由于是在厌氧状态下,酸类不被氧化,所以仍保持黄色。而发酵乳糖的细菌则产生大量的酸,使整个培养基呈现黄色。如菌种接至培养基培养后产生黑色沉淀,是因为某些细菌能分解含硫氨基酸,生成硫化氢,硫化氢和培养基中的铁盐反应,生成黑色的硫化亚铁沉淀。
问:如果三糖铁上斜面红色、底层黄色,中间有黑色且产气,能否判定为沙门菌?
答:不能。某些非沙门菌也能在三糖铁上呈现和沙门菌一样的颜色变化,例如奇异变形杆菌。如三糖铁上有上述颜色变化,需要进一步的进行适宜的鉴定试验,确证是否为沙门菌。
如果采用传统的生化鉴定,可参考GB 4789.4-2016中沙门氏菌检验的方法。
问:按照中国药典2015版1106控制菌检查法检测大肠埃希氏菌,如果麦康凯琼脂上有疑似菌,如何用传统方法确证?
答:挑选疑似菌分离、纯化。
(1)革兰氏染色:革兰氏阴性无芽孢杆菌;
(2)乳糖发酵试验:产酸产气或产酸不产气;
(3)IMVIC试验结果:++--或-+--; 判定检出大肠埃希氏菌。
问:按照中国药典2015版1106控制菌检查法检测铜绿假单胞菌时,溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基中加入甘油的作用是什么?
答:作为碳源补充,有利于绿脓菌素的生成。