摘 要： 建立超高效液相色谱-串联质谱测定红曲中米酵菌酸残留的分析方法。样品经80%甲醇水溶液（含1%氨水）超声提取，取上清液5 mL经MAX强阴离子固相萃取小柱净化，采用Welch Botimate C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），以乙腈-含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液为流动相梯度洗脱，流量为0.3 mL/min，柱温为35 ℃，进样体积为1 μL，采用电喷雾负离子源电离，以多反应监测模式采集信号。米酵菌酸的质量浓度在5.02～1 004 ng/mL范围内与定量离子丰度有良好的线性关系，线性相关系数为0.999 7。样品加标平均回收率为82.3%～96.1%，测定结果的相对标准偏差为0.6%～4.5%（n=6），方法检出限和定量限分别为0.8 ng/g和2.0 ng/g。该方法快速、准确、灵敏，适用于红曲中米酵菌酸的测定。

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱法； 红曲； 米酵菌酸； 固相萃取

 

红曲是曲霉科红曲霉属真菌红曲霉寄生在粳米中而成的红曲米，具有活血化瘀、健脾消食的功效[1]。红曲主要含他汀类、酚酸类、异黄酮类等成分[2]，对于治疗高脂血症、动脉粥样硬化等疾病有较好的临床疗效[3‒5]。米酵菌酸是由椰毒假单胞菌属酵米面亚种产生的一种脂肪代谢类生物毒素，结构稳定，耐高温，难以被消灭[6]，常见于谷物和发酵类米面制品、银耳等[7‒8]。米酵菌酸有很强的毒性作用，对肝、肾、脑神经细胞损害尤为严重[9‒10]，近年来因食用被椰毒假单胞菌污染的食物而造成的中毒死亡事件屡见不鲜[11‒14]。传统的红曲生产是以大米原料，经处理后接种红曲霉发酵制成的，制备过程容易受杂菌污染，且有极大的可能性因感染椰毒假单胞菌而产生危害人体健康的米酵菌酸。目前，仅有文献报道对红曲中桔青霉素和黄曲霉素测定[15‒16]，而关于红曲中米酵菌酸测定方法并无相关研究。目前，米酵菌酸的检测常选择液相色谱法[17‒18]、超高效液相色谱-串联质谱法[19‒20]。与液相色谱法相比，超高效液相色谱-串联质谱法具有分析灵敏度高、专属性强、准确度高、分析周期较短的优点，尤为适用批量样品的快速筛查。笔者对样品提取条件进行优化，建立了超高效液相色谱-串联质谱法测定红曲中的米酵菌酸，与直接提取法处理样品相比[19‒20]，该方法样品纯化程度更高，提高了检测结果的准确性，可为日常风险监控红曲中米酵菌酸残留提供技术支持。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱仪：Nexera X2 UHPLC LC-30AD型，日本岛津株式会社。

三重四级杆串联液相色谱质谱仪：AB SCIEX Triple Quad 4500型，美国AB公司。

电子分析天平：XS205DU型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超声波清洗器：SK8200HP型，上海科导超声仪器有限公司。

超纯水仪：GWB-2E型，北京普析通用仪器有限责任公司。

米酵菌酸标准品：质量分数为99.8%，批号为1124-RB-0019，美国CATO公司。

甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国ACS公司。

甲酸、甲酸铵：均为LC-MS级，德国CNW公司。

Oasis MAX阴离子固相萃取小柱：美国沃特世公司。

红曲样品：共16批，编号分别为S1～S16，柳州市中药材市场。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 色谱仪

色谱柱：Welch Botimate C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm，月旭科技上海股份有限公司)；流动相：A相为乙腈，B相为含0.1%(体积分数)甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液，流量为0.3 mL/min；柱温：35 ℃；进样体积：1 μL；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

1.2.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测模式：负离子模式；监测方式：多反应监测(MRM)模式；离子源温度：350 ℃；离子化电压：-4 500 V；喷雾气压力：379 kPa；辅助加热气压力：379 kPa；母离子：m/z 485.2；定量子离子：m/z 441.2；定性子离子：m/z 397.2；去簇电压：-60 V，碰撞能量：定量子离子为-15 eV，定性子离子为-24 eV。

1.3 溶液配制

米酵菌酸标准储备溶液：100.40 μg/mL，精密称取米酵菌酸标准品10.06 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解稀释至标线，摇匀，于-20 ℃保存备用。

米酵菌酸系列标准工作溶液：分别精密吸取米酵菌酸标准储备溶液适量，分别加入初始流动相，配制成质量浓度分别为5.02、10.04、20.08、50.2、100.4、200.8、502.0、1 004 ng/mL的米酵菌酸系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

精密称取红曲样品2.0 g (准确至0.000 1 g)，置于50 mL离心管中，精密加入80%(体积分数，下同)的甲醇溶液(含体积分数为1%的氨水) 20 mL，超声30 min，以10 000 r/min转速离心5 min，精密量取上清液5 mL，过MAX固相萃取小柱(固相萃取小柱预先用5 mL甲醇和5 mL水活化)，依次用5 mL水、5 mL甲醇淋洗，弃去淋洗液，真空抽干固相萃取小柱，最后用5 mL含2%(体积分数)甲酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液于旋转蒸发仪中蒸干，残渣用初始流动相溶解定容至2 mL，经0.22 μm的微孔滤膜过滤，作为样品溶液。

1.5 样品测定

取米酵菌酸系列标准工作溶液，按1.2仪器工作条件测定，建立米酵菌酸标准工作曲线，在相同条件下测定样品溶液，以标准工作曲线法计算样品中米酵菌酸的含量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 样品处理方法的选择

2.1.1 提取条件

米酵菌酸作为一种脂溶性酸性化合物，在氯仿、甲醇和乙腈等有机溶剂中溶解度较大，故分别选择甲醇、乙腈、氯仿作为溶剂，比较不同提取方式(超声、回流)对提取效率的影响。结果表明，以氯仿作为溶剂时，提取效率最低，甲醇和乙腈基本相当，超声提取效率明显优于回流。出于低毒、经济的综合考虑，选择甲醇为溶剂进行超声提取。

取编号为S4的阳性样品，选择体积分数分别为100%、80%、50%的甲醇溶液为溶剂，超声时间分别选择20、30、60 min，进行提取效果比较，结果见表2。

表2   不同溶剂和不同超声时间时米酵菌酸测定结果

Tab. 2   Determination results of bongkrekic acid under different solvents and ultrasound times

分别选择80%甲醇溶液(含体积分数2%氨水)、80%甲醇溶液(含体积分数1%氨水)、80%甲醇溶液(加氨水调节pH值至8)为提取溶剂对样品进行提取，米酵菌酸质量分数测定结果分别为206.81、208.75、208.63 ng/g，表明以80%甲醇溶液(含体积分数为2%氨水)为溶剂时提取效果较差，以80%甲醇溶液(含体积分数为1%氨水)和80%甲醇溶液(加氨水调节pH值至8)为提取溶剂时，提取效果差别不大，但80%甲醇溶液(含体积分数为1%氨水)作为提取溶剂时，操作最为简便。综合考虑，选择80%甲醇溶液(含1%氨水)为溶剂，超声提取时间为30 min。

2.1.2 净化条件选择

同一提取条件下，比较不同类型固相萃取小柱(C18柱、HLB柱、MAX柱、WAX柱)的分离效果，结果发现，C18柱和HLB柱对米酵菌酸几乎不保留，在淋洗液中均能检测到大量的米酵菌酸，而WAX和MAX固相萃取柱均可以保留米酵菌酸，但WAX柱在淋洗液中能检测到米酵菌酸的存在，MAX柱仅在甲醇(含2%甲酸)的洗脱液中检测到米酵菌酸，可能原因是WAX柱为含有弱碱性基团的混合型弱阴离子交换柱，在中性或酸性水溶液中解离OH-的能力较强，MAX柱为含强碱性基团的混合型强阴离子交换，在任何pH的水溶液中均可解离带正电，2种阴离子交换柱均可与米酵菌酸发生结合而保留下来，但米酵菌酸提取液为碱性溶液，与WAX柱结合效果较差，综上，选用MAX固相萃取小柱净化样品。

2.2 质谱-色谱条件选择

取米酵菌酸标准溶液，选择正、负离子模式分别进行母离子扫描，确立采集模式为[M-H]-，进行二级质谱分析，选择响应值最高且稳定的2种碎片离子分别作为定量和定性子离子，且调谐质谱得到最优质谱参数后，选择m/z 485.2/441.2、485.2/397.2作为MRM检测离子对，与文献[7，19‒20]基本一致。

同一质谱条件下，以不同流动相(体积分数为0.1%的甲酸溶液-甲醇、体积分数为0.1%的甲酸溶液-乙腈、乙腈-含体积分数为0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液)、不同色谱柱[Welch Boltimate C18柱(100 mm×2.1 mm，2.6 μm)、Agilent SB C18柱(50 mm×3.0 mm，1.8 μm)、Shim-Pack XR-ODSIII柱(75 mm×2.0 mm，1.6 μm)]对米酵菌酸标准溶液和样品溶液进行分析，从色谱峰形、响应值、基线等因素考虑，最终选择Welch Boltimate C18 (100 mm×2.1 mm，2.6 μm)色谱柱为分析柱、乙腈-含体积分数为0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸铵溶液为流动相。

2.3 专属性试验

取空白样品溶液、米酵菌酸标准溶液和加标样品溶液，在1.2仪器工作条件下测定，记录总离子流色谱图，结果如图1所示。由图1可以看出，加标样品溶液在与米酵菌酸标准溶液相同保留时间处有相应的色谱峰，而空白样品溶液与米酵菌酸标准溶液保留时间相同的位置上无色谱峰出现，表明方法专属性良好。

图1   空白样品溶液、米酵菌酸标准溶液及加标样品溶液总离子流色谱图

Fig. 1   Total ion flow chromatograms of blank sample solution，bongkrekic acid standard solution and spiked sample solution

 

2.4 线性方程、检出限及定量限

取米酵菌酸系列标准工作溶液各1.0 μL，在1.2仪器工作条件下测定，以定量离子的丰度值作为纵坐标，以米酵菌酸的质量浓度作为横坐标，绘制线性回归方程，得线性回归方程y=1 656.9x+3 221.8，线性相关系数为0.999 7。表明米酵菌酸的质量浓度在5.02～1 004 ng/mL范围内与丰度值呈良好的线

性关系。将米酵菌酸标准溶液用初始流动相稀释，按1.2仪器工作条件测定，分别以3倍信噪比和10倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限和定量限，根据取样质量和定容体积换算成样品中的含量，以质量分数表示，得方法检出限为0.8 ng/g，定量限为2.0 ng/g。

2.5 稳定性试验

取检测结果为阳性的样品，按1.4方法制备样品溶液，分别于第0、2、4、8、16、24、48 h时，在1.2仪器工作条件下测定，结果见表3。由表3可知，所有阳性样品中米酵菌酸离子丰度测定结果的相对标准偏差均不大于6.5%，表明在48 h内样品溶液稳定较好，但米酵菌酸含量较低的样品(如S15)溶液，在16 h后离子丰度降低幅度较大，并且测定结果的相对标准偏差也较大。为了获得更准确的测定结果，建议样品溶液在16 h内进行测定。

表3   稳定性试验结果

Tab. 3   Results of stability tests

 

2.6 加标回收与精密度试验

取检测结果为阴性的样品(编号为S2)，按低、中、高三种质量浓度水平分别添加适量的米酵菌酸标准溶液，每种加标水平按1.2仪器工作条件各平行测定6次，结果见表4。由表4可知，加标平均回收率为82.3%～96.1%，测定结果的相对标准偏差为0.6%～4.5%。表明方法的精密度和准确性均较好。

表4   加标回收与精密度试验结果

Tab. 4   Results of spiked recovery and precision tests

 

3、 结语

 

基于超高效液相色谱-串联质谱法结合固相萃取建立了红曲中米酵菌酸的分析方法。该方法快速、准确、灵敏，适用于红曲中米酵菌酸的测定，可为红曲质量标准的提升提供参考依据。

 

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引用本文： 林华，何畅，吴易君，等 . 超高效液相色谱-串联质谱法测定红曲中米酵菌酸［J］. 化学分析计量，2024，33（9）： 38. (LIN Hua, HE Chang, WU Yijun, et al. Determination of bongkrekic acid in Hongqu by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 38.)