摘 要： 建立高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸的含量。采用Waters Atlantis T3色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）为分离柱，以乙腈-0.1%磷酸（体积比为13∶87）为流动相，流量为1.0 mL/min，进样体积为10 μL，柱温为30 ℃，检测波长为310 nm。对香豆酸的质量浓度在0.28～13.78 mg/L范围内与色谱峰面积线性关系良好，线性相关系数为0.999 9，方法检出限为2.03 mg/kg，定量限为6.06 mg/kg。测定结果的相对标准偏差为0.62%（n=6），样品加标平均回收率为97.97%。该方法的精密度和准确度良好，可用于枸杞中对香豆酸含量的测定。

关键词： 枸杞； 对香豆酸； 高效液相色谱法

 

枸杞为茄科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实，中华人民共和国药典(以下简称中国药典)中记载枸杞具有清热养阴、益肾、平肝等功效，可用于治疗肺痨咯血、骨蒸潮热，头晕目眩等症状[1]。枸杞在我国有着广泛的种植区域，主要产地有宁夏、新疆、甘肃、青海、内蒙古、河北等[2]。研究发现枸杞中富含多糖、黄酮、蒽醌类、萜类、氨基酸、色素、脂肪酸、挥发油、氨基酸、维生素等活性成分[3‒5]，具有抗氧化、抗疲劳、抗衰老、保肝明目、神经保护、降血糖、抗骨质疏松、抗肿瘤等多种生物学活性[6‒11]。

作为一种药食两用的产品，枸杞深受我国人民的喜爱，在我国有着广泛的应用，如采用浸泡或者发酵等生产工艺，可将枸杞作为主要原料制备功能型保健酒[12]。含有枸杞等多种药材的保健酒，具有明显的缓解体力疲劳功能，通过动物实验确认，其缓解体力疲劳的主要成分之一为对香豆酸，通过筛查发现对香豆酸主要来源于枸杞，因此有必要对枸杞中对香豆酸含量进行测定。中国药典中枸杞的控制指标为枸杞多糖和甜菜碱，目前对枸杞的研究主要集中在枸杞多糖等成分上，关于枸杞中对香豆酸的研究则主要集中在该成分的分离、鉴定及生物活性等方面[13‒14]，对其检测方法报道较少。康志欣等[15]利用超高效液相色谱-串联质谱法测定了宁夏枸杞中香豆素类和苯丙酸类9种成分的含量，其中包括对香豆酸。超高效液相色谱-串联质谱法所使用的仪器价格昂贵，对技术人员要求高，而高效液相色谱法快速、灵敏、操作简单、仪器价格也相对较低，是使用较为广泛的方法。笔者建立了高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸含量的检测方法，该方法准确度高、灵敏度高、操作简单，为枸杞药材质量控制提供了一个新的参考依据。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260 Infinity型，配紫外检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：AB135-S型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

恒温水浴锅：DZKW-D-6型，北京市永光明医疗仪器有限公司。

纯水机：ELGA Option-Q型，法国威立雅环境集团。

甲醇、乙醇：均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司。

乙腈、磷酸：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

对香豆酸对照品：纯度(质量分数)为99.7%，批号为112037-202102，中国食品药品检定研究院。

枸杞药材样品：共54个批次，分别采自宁夏中宁、甘肃玉门、甘肃靖远、青海海西州4个不同的产地。

实验用水为超纯水，电阻率不低于18.2 MΩ·cm。

1.2 色谱条件

色谱柱：Waters Atlantis T3柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国沃特世科技有限公司)；柱温：30 ℃；流动相：乙腈-0.1%(体积分数，下同)磷酸水溶液(体积比为13∶87)；流量：1.0 mL/min；进样体积：10 μL；检测波长：310 nm。

1.3 溶液配制

对香豆酸对照品储备液：275.57 mg/L，精密称取对香豆酸对照品6.91 mg，置于25 mL容量瓶中，用50% (体积分数，下同)甲醇溶液溶解并定容至标线。

对香豆酸对照品溶液：27.56 mg/L，取对香豆酸对照品储备液2.5 mL于25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶液定容至标线。

对香豆酸系列标准工作溶液：分别精密量取对香豆酸对照品溶液0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置于6只10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液定容至标线，摇匀，配制成对香豆酸的质量浓度分别为0.28、0.83、1.38、2.76、5.51、13.78 mg/L的系列标准工作溶液。

1.4 样品处理

精密称取枸杞药材粉末约0.5 g于锥形瓶中，加入70% (体积分数，下同)乙醇溶液20 mL，称定质量，加热回流30 min，取出，冷却，再称定质量，用70%乙醇溶液补足失去的质量，摇匀，用0.22 μm针头过滤器过滤，得样品溶液。

1.5 样品测定

取对香豆酸系列标准工作溶液、样品溶液，按照1.2色谱条件测定，以色谱峰面积外标法计算枸杞药材中对香豆酸的含量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 色谱条件优化

2.1.1 检测波长的选择

用二极管阵列检测器将对香豆酸对照品储备液在210～400 nm波长范围内进行扫描，其光谱图如图1所示。由图1可以看出，对香豆酸在310 nm处有最大吸收，故设置检测波长为310 nm。

图1   对香豆酸吸收光谱图

Fig. 1   Spectrogram of p-coumaric acid

2.1.2 流动相组成的选择

对香豆酸在酸性流动相体系下能够正常出峰，分别考察了乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%(体积分数)甲酸水溶液、乙腈-0.1%乙(体积分数)酸水溶液3种流动相体系下对香豆酸色谱峰的理论塔板数和对称因子，结果见表1。由表1可知，以乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相体系时，对香豆酸色谱峰的理论塔板数最高，色谱峰的对称性最好，故选择乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相。

表1   不同流动相体系下对香豆酸色谱峰的理论塔板数和对称因子

Tab. 1   Theoretical plate number and symmetry factor of p-coumaric coumaric acid in different mobile phase systems

 

2.1.3 流动相比例的选择

以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相，分别考察乙腈和0.1%磷酸水溶液体积比为20∶80、13∶87、10∶90等度洗脱时，枸杞药材样品溶液中对香豆酸的分离效果。结果表明，当乙腈和0.1%磷酸水溶液体积比为13∶87时，枸杞样品溶液中对香豆酸能够有效分离，且色谱峰形较好，故选择乙腈和0.1%磷酸水溶液体积比为13∶87。

2.1.4 色谱柱的选择

检测药材中有效成分的色谱柱大部分以十八烷基硅烷键合硅胶(C18)为填料，分别考察了Waters Atlantis T3柱、Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱、Sepax HP-C18柱(均为250 mm×4.6 mm，5 μm)，对枸杞药材中对香豆酸的分离效果。结果表明，用Sepax HP C18色谱柱分析时，对香豆酸色谱峰形较差，用Agilent ZORBAX SB-Aq C18色谱柱分析时，对香豆酸的分离度较低，用Waters Atlantis T3色谱柱时，对香豆酸的色谱峰形与分离度较好，故选择Waters Atlantis T3柱。

2.2 样品提取条件优化

枸杞中的对香豆酸存在游离型、游离酯型、可溶性糖苷型、结合型、不溶性糖苷型5种类型[16‒17]，提取枸杞中的对香豆酸时，一般采用一定浓度的乙醇为溶剂，该方法提取出的是游离型对香豆酸，其含量较低；其他结合态对香豆酸以酯键、糖苷键、醚键与木素、多糖等连接，形成复合结构，需要采用酸碱水解等方式提取[18]，这种方式所得对香豆酸含量较高，但枸杞在日常使用过程中，一般很少会用酸碱进行提取，因此笔者仅对枸杞中游离型对香豆酸进行提取。

2.2.1 样品提取方式的选择

分别考察了超声和回流两种提取方式，发现回流提取所得枸杞中对香豆酸的含量高于超声提取，故选择回流提取方式。

2.2.2 提取溶剂的选择

分别考察不同体积分数的甲醇溶液、乙醇溶液作为提取溶剂时枸杞药材中对香豆酸的测定结果，结果见表2。由表2可知，用70%(体积分数，下同)乙醇溶液作为提取溶剂时，所得枸杞药材中对香豆酸的含量相对较高，故选择70%乙醇溶液作为提取溶剂。

表2   不同提取溶剂时对香豆酸的测定结果

Tab. 2   Determination results of p-coumaric acid using different extraction solvents

2.2.3 提取时间的选择

选择70%乙醇溶液作为提取溶剂，分别考察不同提取时间时枸杞药材中对香豆酸的测定结果，结果见表3。由表3可知，加热回流提取30 min，对香豆酸提取率相对较高，故选择提取时间为30 min。

表3   不同提取时间时对香豆酸的测定结果

Tab. 3   Determination results of p-coumaric acid at different extraction times

 

2.3 色谱图

按照1.2色谱条件，测定对香豆酸对照品溶液及样品溶液，色谱图分别如图2～图3所示。

图2   对香豆酸对照品溶液色谱图

Fig. 2   Chromatogram of coumaric acid reference solution

图3   样品溶液色谱图

Fig. 3   Chromatogram of sample solution

2.4 线性方程和检出限

在1.2色谱条件下测定对香豆酸系列标准工作溶液，结果见表4。以对香豆酸标准工作溶液的质量浓度(x)为横坐标，对应的色谱峰面积(y)为纵坐标进行线性回归，计算线性回归方程和相关系数。得到对香豆酸线性回归方程为y=76.439 6x-0.635 3，线性相关系数为0.999 9，表明对香豆酸的质量浓度在0.28～13.78 mg/L范围内线性关系良好。

表4   对香豆酸系列标准工作溶液测定结果

Tab. 4   Determination results of series standard working solutions of p-coumaric acid

 

将对香豆酸对照品溶液进行逐级稀释，以3倍信噪比所对应的目标物在样品中的质量分数作为方法检出限，以10倍信噪比所对应的目标物在样品中的质量分数作为方法定量限。得到方法检出限为2.03 mg/kg、定量限为6.06 mg/kg。

2.5 精密度试验

取同一批次枸杞粉末6份，分别按照1.4样品处理方法制备样品溶液，在1.2色谱条件下测定，计算对香豆酸的质量分数以及相对标准偏差，结果见表5。由表5可知，枸杞中对香豆酸平均含量(质量分数)为113.63 mg/kg，测定结果的相对标准偏差为0.62%。表明该方法的精密度良好。

表5   精密度试验结果

Tab. 5   Results of precision test

 

2.6 稳定性试验

取同一枸杞样品溶液，分别在制备完成后第0、2、4、8、16、24 h进样测定，结果见表6。由表6可知，对香豆酸色谱峰面积测定结果的相对标准偏差为0.83%，表明制备的样品溶液在24 h内稳定性良好。

表6   稳定性试验结果

Tab. 6   Results of stability test

 

2.7 样品加标回收试验

取已知对香豆酸含量的枸杞药材粉末9份，每份约0.25 g，精密称定，置于锥形瓶中，分别加入适量对香豆酸对照品溶液，按照1.4样品处理方法制备样品溶液，在1.2色谱条件下进行测定，结果见表7。由表7可知，对香豆酸的加标平均回收率为97.97%，表明该方法准确度良好。

表7   加标回收试验结果

Tab. 7   Results of recoveries test

 

3、 结语

 

建立了高效液相色谱测定枸杞中对香豆酸含量的方法，该方法简便、准确、灵敏度高，可以作为枸杞全面质量控制和产地区别的参考方法。

 

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引用本文： 石豪，毛琼丽，严玲，等 . 高效液相色谱法测定枸杞中对香豆酸［J］. 化学分析计量，2024，33（9）：64. (SHI Hao, MAO Qiongli, YAN Ling, et al. Determination of p-coumaric acid in Lycium barbarum by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(9): 64.)