一、准备工作

1、试剂准备：培养细胞所需的培养基、胰酶、胎牛血清（简称FBS）、双抗（简称P/S）、PBS缓冲液等从4℃的冰箱中取出，于室温条件下放置至恢复室温。

2、耗材准备：50mL离心管、15mL离心管等及移液枪。

3、实验条件准备：打开超净台紫外灯照射30mins之后通风3-5mins即可开始实验。

二、实验步骤

1、洁净要求：进入细胞间后，穿好实验服，戴好口罩手套等实验装备，将上述试剂耗材用酒精喷洗后放入超净台，手部同样酒精喷洗即可开始。

2、试剂分装及配制：

（1）配制完全培养基：完全培养基（血清占总体积10 %，双抗占总体积1%的基础培养基混合液）一般用50ml离心管配制，减少污染的概率。即在50mL离心管中加入5mL FBS和500μL P/S后倒入基础培养基定容到50mL，即得50mL完全培养基。用马克笔在离心管壁上写好配制时间及溶液成分。放于一旁试剂架上备用。

（2）分装PBS：将PBS从瓶中倒入50mL离心管中，倒PBS时注意瓶口和管口不要接触，防止整瓶污染。标记好后也置于试剂架上备用。

3、细胞消化及传代：

（1）细胞状态的观察及传代准备：手部酒精喷洗后，将细胞培养皿或培养瓶从恒温培养箱中取出，于倒置显微镜下观察细胞密度，已经生长到80%-90%的细胞密度即可传代。手部再次酒精喷洗，顺便将培养皿也喷一下，放入超净台。

（2）清洗：先用移液枪移除原有细胞培养液，更换枪头后加入2mL PBS清洗1~2次（沿培养皿壁处加入，防止冲散贴壁细胞，加入后轻轻摇荡，洗去残余的培养液和悬浮的细胞），用移液枪移除PBS；注意弃掉PBS时，枪头应在废液缸上方，不要将枪头伸入废液缸中，防止回溅造成污染。

（3）消化：沿培养皿侧壁加入1-2mL胰酶（能够覆盖细胞表面即可）消化约2-5mins（水解细胞间蛋白质，使贴壁细胞脱离附着的底物，解离、分散细胞），在倒置显微镜下观察到细胞形态由不规则逐渐皱缩为圆形即为消化完全。

（4）终止消化：加入3mL完全培养基或将加入的胰酶弃去均可终止胰酶消化。用移液枪反复吹打培养皿皿底壁或培养瓶底壁使细胞脱离皿底壁（注意边缘地带和四角处，吹打力度适中，防止产生伤害细胞的气泡）。

（5）离心：取吹打后的培养液转移至15mL离心管中，离心机1000rpm，5mins得到单细胞沉淀。

（6）为节省时间，可在离心过程中准备传代所需的培养皿（1:n传代就准备n个培养皿），各加入9mL完全培养基，在皿盖上标好培养的细胞种类、细胞代数、传代时间和操作人员。

（7）离心好的细胞弃上清得到单细胞沉淀，将细胞沉淀用2-3mL完全培养液重新悬浮，分n份分别加入刚刚的培养皿中，并于光学显微镜下观察细胞密度。酒精喷洗后放入恒温培养箱培养即可。（10cm皿一皿培养基10mL；T25细胞培养瓶一瓶培养基5mL）。

4、结束操作：

（1）将所有未用完试剂的离心管用封口膜包好，同废液缸一起拿出超净台。

（2）整理移液枪及耗材位置，用酒精喷湿吸水纸擦拭超净台，关闭超净台灯光。

（3）废液倒入废液回收瓶，废弃耗材装入黄色专用垃圾袋，等待统一回收处理。试剂放回4℃冰箱中冷藏。

（4）记录今日实验操作内容及结果，方便日后回顾。

三、注意事项

1、细胞消化中的注意事项

（1）消化细胞可能会由于商品化胰酶的品牌、实验室温度或细胞种类等造成消化时间上的差异，建议首次消化细胞时在加入胰酶后就转移至倒置显微镜下观察细胞状态并记录时间。

（2）消化细胞熟练之后可以观察到消化完成后的培养皿或培养瓶底壁呈现雾面。

（3）若5mins后细胞状态没有明显变化，可以将培养皿重新放回培养箱在37℃下孵育消化，或者更换别的品牌的胰酶尝试。

（4）若消化过度则细胞会随着分散在胰酶中，此时弃去胰酶终止消化会造成细胞的损失，应加入含血清的培养基终止消化后离心去除。

（5）若细胞消化未完全就终止消化，细胞会贴在皿底很难吹打下来，可以再加入胰酶重新消化。

2、细胞传代时的注意事项

（1）首先可以在ATCC上查找细胞的传代比例，然后根据细胞培养的状态判断传代的合适比例。若细胞传代过稀则可能会导致细胞不能扩增，若过密则影响细胞生长状态。

（2）细胞传代天数的控制也很重要。若长时间不传代，细胞培养基颜色变黄，则证明培养基中的pH发生变化，会影响细胞状态。