摘  要 / Abstract

中草药目前是化妆品原料添加的研究热点，铁皮石斛是我国传统中药材，其提取物可作为化妆品原料，具有抗皱紧致作用。目前大多数提取工艺的产物分子量较大，对于低分子量铁皮石斛的功效未见相关的研究报道。本实验通过观察和比较铁皮石斛提取物中具有保湿和抗皱功效的基因表达，初步探讨其作用机制。本实验对保湿因子（AQP-3）、透明质酸（HA）和胶原蛋白（COL-I）基因表达含量进行检测，测试结果表明1%浓度超低分子石斛多糖能够有效提高这三种基因的表达含量。超低分子石斛多糖可能通过上调胶原蛋白和保湿因子的表达，抑制胶原蛋白降解，改善皮肤屏障和增加皮肤水分，从而减少皮肤老化，发挥抗皱功效。同时，与市售铁皮石斛提取物相比，1%浓度超低分子石斛多糖在细胞层面具有更好的保湿、抗皱功效。超低分子石斛多糖可作为保湿抗皱的原料，应用于皮肤护理领域。

Chinese herbal medicine is currently a hot research topic of cosmetic ingredient additives. Dendrobium officinale is a traditional Chinese herb, its extract can be used as a cosmetic ingredient and has anti-wrinkle and firming effects. Most of the current extraction processes result in products with larger molecular weights. However, there have been no relevant research reports on the efficacy of low molecular weight Dendrobium officinale. This experiment preliminarily explores its mechanism of action by observing and comparing the expression of genes with moisturizing and anti-wrinkle effects of Dendrobium officinale extract. The experiment detected the genes expression levels of the hyaluronic acid (HA), collagen (COL-I), and aquaporin-3 (AQP-3), and the results showed that ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides (1%) could effectively increase the expression levels of these three genes. Ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides may exert anti-wrinkle effects by upregulating the expression of collagen and moisturizing factors, inhibiting collagen degradation, improving the skin barrier, increasing skin moisture and thus reducing skin aging. Meanwhile, compared with commercially available Dendrobium officinale extracts, ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides at a concentration of 1% have better moisturizing and anti-wrinkle effects at the cellular level. Ultra-low molecular weight Dendrobium officinale polysaccharides can be used as moisturizing and anti-wrinkle ingredients and applied to the field of skin care.

关 键 词 / Key words

铁皮石斛；多糖提取物；促胶原生成；抗皱；双酶解工艺

dendrobium officinale; polysaccharide extract; promoting collagen synthesis; anti-wrinkle; dual enzymatic process

皮肤皱纹是一系列多因素造成的复杂过程，导致皮肤某些功能及美学改变[1]。随着年龄增长，多种内部或外部因素导致表皮细胞的增殖活性衰退，表皮变薄[2-3]；真皮胶原蛋白纤维的减少以及基质金属蛋白酶活化或增多， 导致胶原蛋白的分解和断裂，进一步引发真皮胶原蛋白纤维束构造紊乱；皮肤中的透明质酸（hyaluronic acid，HA）减少，特别是表皮的保水性变差[4-5]。

目前，已经有大量的研究发现多糖具有显著的抗衰老作用，多糖结构中含有半缩醛羟基，具有还原作用。有些多糖还可以增强皮肤细胞内抗氧化酶的活性， 从而缓解皮肤氧化损伤， 延缓皮肤衰老[6-9]。近年来的现代药理药效学研究发现，铁皮石斛具有较强的抗氧化、保湿和抗皱等活性。铁皮石斛多糖作为铁皮石斛最主要的活性成分促胶原生成、抗氧化功效有着密切的联系[10]。多糖的生物活性与分子结构、主链组成、相对分子量、分支程度、主链配置和化学修饰等密切相关[11]。故此，多糖的相对分子量大小会对其活性产生一定影响。

已经有研究表明不同分子量的石斛多糖具有不同的功效， 小分子量的石斛多糖的抗氧化活性更高，这为石斛多糖的抗皱机制奠定了基础[12-13]。本研究采用特定的酶切工艺，制备小分子量3000Da石斛多糖，评价其体外的抗皱功效，为后续超低分子铁皮石斛多糖作为功效性化妆品添加剂，开发具有特定功效的化妆品提供了相关的理论依据。

1、实验部分

1.1 主要材料、实验试剂和仪器

材料：铁皮石斛（安徽霍山铁皮石斛基地，批号20200403），市售铁皮石斛提取物（博林生物，批号20230707）。

试剂：胎牛血清（FBS）（美国吉布斯生物科技公司，批号20230919），果胶酶（实验室自研，批号20230302）， 纤维素酶（实验室自研， 批号20230317），表皮细胞生长因子（EGF）（美国吉布斯生物科技公司，批号20230711），人真皮成纤维细胞（HSF）（北京伊瑞莱生物，批号20230313），pH7.4 缓冲溶液（PBS）（美国吉布斯生物科技公司，批号20230801），高糖培养基（H-DMEM）（美国吉布斯生物科技公司，批号20230801），RNA 提取试剂盒（上海美基生物，批号20230519），逆转录试剂盒（日本塔克拉生物， 批号20230519）， 荧光定量PCR 试剂盒（上海碧云天生物，批号20230512），透明质酸ELISA 检测试剂盒（上海江莱生物，批号20230519），I 型胶原（COL-I）ELISA 检测试剂盒（南京博研生物，批号20230519）。

仪器：Herocell 180 二氧化碳培养箱（赛默飞世尔科技公司），CKX53 倒置荧光显微镜，（日本奥林巴斯有限公司），THZ-D 恒温摇床（杭州米欧仪器有限公司）， AB204STHZ-D 电子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司），LC-36 台式低速离心机（上海安亭科学仪器），VeritiPro PCR 逆转录仪（赛默飞世尔科技公司），ABIQS5 实时荧光定量PCR 仪（赛默飞世尔科技公司），SW-CJ-2FD 超净工作台（山东博科有限公司）， 1260 高效液相（HPLC）色谱仪（美国安捷伦公司），-80℃冰箱（海尔DW86L486）。

1.2 实验方法

1.2.1 超低分子铁皮石斛多糖制备

将铁皮石斛洗净，60℃烘干后机械粉碎。加入超纯水，投入铁皮石斛粉末，投料质量比为1 ∶40。加入纤维素酶在60℃下搅拌1h，随后升温至90℃搅拌3h。加入果胶酶，50℃搅拌1h。升温90℃加热30min，随后降温至40℃，静置过夜。2.5μl滤膜过滤得到超低分子铁皮石斛多糖。

1.2.2 超低分子铁皮石斛多糖分子量和多糖组成

将石斛多糖样品溶于0.2mol/L NaCl，配制终浓度为2mg/ml。用1ml 的注射器抽起过滤，随后在HPLC 中进样。流动相为0.2mol/L NaCl，层析温度为40℃，流速为0.6ml/min，以右旋糖酐为标准品进行石斛多糖分子量分析测定。将水解后的石斛多糖进样于凝胶层析柱进行检测，根据其保留时间值确定多糖组成。

1.2.3 超低分子铁皮石斛多糖-体外功效评价

1.2.3.1 细胞接种

超低分子铁皮石斛多糖使用无菌PBS 梯度稀释，分别配置成1%、0.5%、0.1%的超低分子铁皮石斛多糖稀释液（v/v），EGF 使用无菌PBS 配置成10ng/ml 的溶液备用。

取对数期生长的HSF 细胞接种于培养瓶中，待生长至密度超过80%用胰酶消化收集计数。使用完全培养基（90% H-DMEM+9% FBS+1% PS）（v/v）将细胞悬液进行稀释，按照细胞数1.0 ×105 /孔接种于6 孔板中。置于37℃，5% CO2 培养箱中培养6~12h，使细胞正常铺展。随后弃去完全培养基，分为空白组、阳性对照组、实验组，分别加入对应的条件培养基，培养24h 后分别收集细胞和上清液。空白组：完全培养基（2ml）。阳性对照组：EGF（1ml）+完全培养基（1ml）。实验组：超低分子铁皮石斛多糖使用完全培养基。各组分别加入1%、0.5%、0.1%（v/v）浓度的低分子铁皮石斛稀释液。

1.2.3.2 透明质酸表达测定

收集细胞上清液，分别用对应的ELISA 试剂盒，根据说明书用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中HA 表达水平。用纯化的透明质酸结合蛋白（HABP）包被微孔板，制成固相抗体，向包被单抗的微孔中依次加入HA、生物素化的抗大鼠透明质酸结合蛋白（HABP）、辣根过氧化酶（HRP）标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物3, 3′, 5, 5′-四甲基联苯胺（TMB）显色。TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝色， 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的透明质酸含量呈正相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

1.2.3.3 水通道蛋白3（AQP-3）和I 型胶原（COL-I）、III型胶原（COL-III）mRNA 表达测定

收集培养后的细胞，按照RNA 提取试剂盒说明书进行操作。在离心管中加入300μl 裂解液（buffer RL ∶DTT =5ml ∶100μl），连续吹打使细胞充分裂解， 加入到过滤柱中， 12000 ×g 离心1min。弃去过滤柱，在收集管中加入330μl 70%乙醇溶液，8000 ×g 离心1min，弃去收集管。将过滤柱套入新收集管，加入600μl RNA 裂解液1，8000 ×g 离心1min。弃去收集管内液体， 加入600μl RNA 裂解液2，8000 ×g 离心1min。弃去液体，空柱在13000 ×g 离心3min。将过滤柱套入无菌无酶离心管中，在过滤柱中心加入15μl 无酶水，静置1min，10000 ×g 离心1min，弃去过滤柱。

按照试剂盒说明进行逆转录，根据样品RNA 含量加入对应的焦碳酸二乙酯（DEPC）水和样品量。放入PCR 仪中逆转录。运行结束后得到cDNA，放入-80℃冰箱保存。

将逆转录的cDNA 用无酶水稀释10 倍，根据荧光PCR 试剂盒操作说明， 分别测试AQP-3、COL-I 和COL-III 的表达情况，引物详见表1。

1.2.4 超低分子铁皮石斛多糖和市售铁皮石斛提取物对比

1.2.4.1 I 型胶原、III 型胶原的mRNA 表达测定

参照1.2.3.3 测试方案，检测超低分子铁皮石斛多糖[1%（v/v）]、市售铁皮石斛提取物[1%（v/v）]在HSF 细胞中I 型胶原、III 型胶原的表达情况。

1.2.4.2 水通道蛋白3（AQP-3） mRNA 表达测定

参照1.2.2.3 测试方案，对5%（v/v）的超低分子铁皮石斛多糖、5%（v/ v）市售铁皮石斛提取物进行水通道蛋白3（AQP-3）mRNA 表达测试。

1.3 统计学分析

所有试验数据采用GraphPad Prism 8.0 中的one-way ANOVA 方法对数据进行统计差异分析，结果以Mean ± SD 的方式表示，其中 p＜0.05 表示差异具有统计学意义，p越小，差异性越明显。

2、结果与讨论

常规的石斛多糖为大分子物质，过高的分子量可能会使其在针对皮肤使用的过程中无法有效到达作用位点。本研究选择了酶解的方式，在保证石斛多糖活性的前提下，降低其分子量。针对石斛多糖的单糖组成，筛选了一个双酶体系，石斛多糖通过该体系进行酶解，能有效的提高活性并且降低分子量。经检测，其平均分子量为3.66kDa，详见表2。此外，在石斛多糖酶解后，其主要成分为D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖，这对保湿和抗皱是有利的。

皮肤真皮层的主要细胞——成纤维细胞与其分泌的胶原纤维、弹力纤维及基质成分共同构成了真皮的主体，因此成纤维细胞生物学特性的改变，是皱纹形成的根本原因[14]。胶原纤维是皮肤中主要的结构蛋白，也是含量最丰富的蛋白质，对皮肤的弹性和顺应性起着重要的作用。透明质酸是广泛存在于生物体内的一种氨基聚糖， 具有超强的吸水能力，可以吸取自身体积1000 倍的水分，形成一种有弹性的黏性基质填充在组织的空隙内，是维持皮肤组织稳定和弹性的重要细胞外基质[15]。水通道蛋白3（AQP-3）是细胞膜上的一种物质，负责水、甘油及尿素等物质的运输，属于一种转运蛋白因子，主要表达于角质形成细胞和皮肤成纤维细胞。AQP-3 不仅参与皮肤水合、屏障功能， 同时在皮肤损伤和修复、愈合方面，均发挥着重要的作用，是皮肤正常形态和功能维持的重要保障[16]。已有大量研究采用体外检测手段来评价化妆品原料是否具有相应的功效[17-18]。本实验通过添加不同浓度的超低分子铁皮石斛多糖，检测成纤维细胞透明质酸、胶原蛋白和AQP-3 的含量来验证超低分子铁皮石斛多糖对于成纤维细胞的抗皱功效。

2.2 超低分子铁皮石斛多糖的作用

2.2.1 在HSF 细胞系中对透明质酸生成的影响

HA 在维持细胞外基质、保湿、调节渗透压方面发挥重要作用。而一旦皮肤中的HA 含量减少，则皮肤的保湿功能减弱， 皮肤会变得粗糙并产生皱纹。另外HA 还具有抗炎作用，当炎症因子被抑制后，多种弹性金属蛋白酶下调，这也有助于HA 发挥抗炎作用[19-20]。游离的HA 减少，皮肤的水和能力下降，会导致皮肤组织细胞皱缩、老化，出现皮肤组织形态学改变。1%浓度的超低分子铁皮石斛稀释液实验组较阳性对照组对HA 的含量具有明显提升（p＜0.05），而浓度为0.5%和0.1%的实验组与空白对照组相比没有差异性， 见图1。这表明1%的低分子铁皮石斛多糖可以有效的提高HA 的表达水平含量，通过HA 实现改善皮肤保水量，从而间接促进角质层的修复。

2.2.2 在HSF 细胞系中对I 型胶原生成的影响

研究表明，胶原蛋白含量变化是影响皮肤结构状态的关键因素[21]，皮肤老化会导致I 型胶原蛋白（COL-I）和III 型胶原蛋白（COL-III）减少，其发生机制涉及到胶原蛋白合成与分解。超低分子铁皮石斛多糖能够促进细胞的新陈代谢，加快皮肤细胞核酸和蛋白质的合成，刺激皮肤成纤维细胞的活性，促进胶原蛋白合成，降低皮肤成纤维细胞凋亡率，从而延缓皮肤衰老和皱纹的发生。其中浓度为1%的超低分子铁皮石斛多糖对于COL-I 生成具有较好的促进作用， 且具有统计学差异（p＜0.05），而0.5% 和0.1% 与空白对照组相比没有差异性，见图2。

2.2.3 在HSF 细胞系中对AQP-3 生成的影响

已有大量的实验研究表明导致皱纹的产生原因之一是皮肤水分流失[22-23]，造成皮肤干燥，从而对皮肤产生不可逆的损伤。水从基底组织扩散到角质层，并诱导角质层的进一步水合作用，在这个过程中，皮肤水分不断渗透进入基底层。AQP-3 是维持皮肤水合作用的重要转运蛋白，参与细胞物质的吸收和分泌，有助于维持弹性和修复损伤[24]。1%的实验组相较于空白对照组AQP-3 的mRNA 水平明显降低（p＜0.05），见图3。超低分子铁皮石斛多糖具有大量能与水分子结合的羟基和羧基等极性基团，从而使其具有吸水性。同时超低分子铁皮石斛多糖能够打开皮肤的水合通道，促进水分子在皮肤的转运，进而改善皮肤含水量，提升保湿功能减少皱纹产生。

2.3 超低分子铁皮石斛多糖与市售铁皮石斛提取物的对比

2.3.1 I 型胶原、III 型胶原mRNA 表达比较

超低分子铁皮石斛多糖能够促进细胞的新陈代谢，刺激皮肤成纤维细胞的活性，加快皮肤表皮和真皮细胞中DNA 的合成与转录，促进胶原蛋白合成，抵抗外界刺激诱导的凋亡，从而延缓皮肤衰老和皱纹的发生。当浓度为1%时，超低分子铁皮石斛多糖对于COL-I、COL-III 生成具有明显的促进作用（p＜0.05），同时，其促进COL-I、COL-III 的作用显著优于同等检测条件下的市售铁皮石斛提取物，具有显著性差异（p＜0.05），见图4 和图5。

2.3.2 AQP-3 mRNA 表达比较

超低分子铁皮石斛多糖在浓度1%时，可显著上调AQP-3 的基因表达（p＜0.001），且与市售铁皮石斛提取物相比，在相同浓度下，超低分子铁皮石斛多糖上调AQP-3 mRNA 表达的效果更好，表明超低分子铁皮石斛多糖在体外具有更优的保湿作用，见图6。

3、结    论

皮肤老化与表皮角质层屏障功能的丧失和水分含量减少有关，修复角质层屏障和保持皮肤高水合作用是改善光老化的重要因素，维持表皮角质层的最佳水合作用水平很大程度上取决于角质化包膜的成分和天然保湿因子。胶原蛋白是维持皮肤饱满充盈的物质基础，I 型胶原约占皮肤胶原成分80%。同时，AQP-3 和HA 又是维持皮肤角质层水合的重要因素。因此为了研究超低分子铁皮石斛多糖是否能保护HSF 细胞起到皮肤屏障功能，从而在表观上减少皱纹的产生，本实验采用实时荧光PCR技术和ELISA 技术测定了上述相关标志物。通过研究发现，超低分子铁皮石斛多糖可以提高HA 和COL-I 的表达，并且恢复AQP-3 的转录水平。根据实验结果，超低分子铁皮石斛多糖改善皮肤角质屏障和皮肤水分的最低起效浓度为1%，说明超低分子铁皮石斛多糖可能通过改善皮肤屏障和增加皮肤水分从而减少皮肤皱纹。对比市售铁皮石斛提取物，在1%检测浓度下，超低分子铁皮石斛多糖具有更好的促进胶原蛋白基因表达及上调AQP-3 基因的能力，表明超低分子铁皮石斛多糖在抗皱功效上优于市售铁皮石斛提取物。

目前市面上抗皱日化用品和功效型化妆品的效果不理想， 超低分子铁皮石斛多糖以其独特的优势，在体外层面呈现了显著的抗皱效果，为抗皱研究提供了新思路。