这一期我们分享原代培养的入门知识，其中不会涉及具体的操作步骤，而是向刚入门的同学科普这个实验的基础。

包括以下内容：

原代培养的概念和流程

分离组织的操作和注意事项

解离组织获取细胞的三种常见方法

原代培养是指细胞分离之后至第一次传代之前的细胞培养阶段，之后细胞就转变成细胞系。

原代培养可分为 4 个步骤:

获取样品

分离组织

解剖或解离组织

接种于培养器皿中培养

用于原代培养的样品可来源于2类，一是实验室样本，包括实验动物的器官、组织，例如胚胎、肠道等；二是临床样本，例如通过手术过程分离出来的病人组织。

分离组织

分离组织的时候，要注意无菌操作，在无菌环境下切除组织，并将其至于PBS缓冲液或运输专用的培养基中转移至下一步操作的实验室内。

另外，分离组织时有2个小技巧：

在取材时可以尽量多去除脂肪和坏死的组织。

使用锋利的手术刀将组织切碎，以减小对组织的损伤

获取细胞

获取组织之后，我们要把细胞从组织中分离出来继续生长，这个操作可分为两种:

将组织块贴附于适宜的基质中，细胞可从组织块向外迁移生长，这个操作过程叫原代外植;

将组织块用机械法或酶消化法处理获得细胞悬液，接种细胞悬液，其中部分细胞最终将黏附于基质开始生长。

如果所取组织很小，则适于用原代外植法；如果组织较大，可用酶消化法以获得更多的细胞。

软的组织适合于用机械法解离，一些硬的组织，如果产物的多少并不重要，或者从纤维间质组织分离松散黏附的细胞，也可用机械法分离。

下图是不同处理方法的路线图，同学们可以用于参考。

相对于原代外植，酶处理或机械法分离出细胞可以有效避免细胞因迁移率不同而选择性生长的问题。

同时，酶解法可以在比较短的时间内培养出大量的细胞，因此，在实验室中较常见，我们选择这两种方法来详细讲解。

胰蛋白酶处理

酶处理方法主要分为胰蛋白酶和胶原酶处理，而胰蛋白酶的反应条件来划分又可以分为冷胰蛋白酶和温胰蛋白酶两种。

温胰蛋白酶消化技术适于在相对短的时间消化大的组织，尤其对于整个小鼠胚胎或鸡胚。

由于成年组织含有大量纤维结缔组织，故对成年组织效果不好，机械搅拌可损伤较敏感的细胞，如上皮细胞。

用胰蛋白酶消化组织的缺点之一是于 37度条件下长期作用可损伤细胞，因此采用温胰蛋白酶消化法，每隔30min收集一次细胞，而不是将组织一直浸泡在胰蛋白酶中(3~4h)等待其完全消化。

与温消化相比,冷消化可获得较高的细胞存活率,培养24h 后生存率也提高。同时可保留更多的细胞种类。

例如，经冷消化处理的小鼠胚胎培养物含有更多的上皮细胞。冷消化也很方便，因为不用搅拌和离心，在4度条件下过夜即可。然而，这种方法受限于一次可处理的组织量。

胶原酶处理

如果组织含有大量纤维成分，又对胰蛋白酶非常敏感而不能使用胰蛋白酶消化的话。常用的是用胶原酶来消化处理。例如人的肿瘤组织、小鼠肾脏。

使用胶原酶消化的过程比较慢但比较缓和，无需机械振荡和特殊设备。对于大于1g 的组织，由于消化时间过长，费用也会非常高，因为需要大量的胶原酶。

胶原酶可解离大多数结缔组织，但存在成纤维细胞过度生长的问题，故需要再进行选择性培养或进行细胞分离。

机械法处理

最后，就是机械法解离细胞。有几种操作可以通过机械解离收集到细胞：

切碎或“溢出”，切割作用或被切表面的破损使细胞释放出来

筛网挤压，用注射器芯将组织挤压过筛网

注射器吸打，将组织吸入注射器中，通过-个大孔径的针头或导管将液体快速打出

用吸管打碎，用大孔径的吸管吸取组织块上下吹打

适用于机械解离的样本仅仅是较软的组织，如脾、胚肝、胚脑、成年脑或部分人和动物的软质肿瘤。

对于脑，即使易于做到完全分解，然而与酶消化的结果相比，虽然花费的时间较少，但悬液中存活的细胞数也少。

若组织取材不受限，细胞数量无关紧要，在短时间内机械法可产生与酶消化同样多的活细胞，但这种方法要消耗更多的组织，同时，死细胞可通过离心而去除。

总结

分离组织并进行原代培养，是特殊功能细胞培养的第一个也是最重要的阶段。

若在这一阶段细胞丢失了，则是不可补救的。因此，我有2个建议给大家：

1 原代细胞存活率较低，因此接种密度可以比常规的细胞系要更高，营养条件也可以适当提高，例如采用胎牛血清而不是小牛血清进行培养。

2 不同种类的细胞应采用相应的解离方法，例如，胰蛋白酶比胶原酶作用强，建立单细胞悬液更高效；胶原酶不能解离上皮细胞，但这一特性成为它的一个优点，可利用它使上皮细胞与间质细胞分离并保持上皮细胞团的活力。机械法比酶消化法快，但对细胞损伤大。