巨噬细胞身为机体免疫系统里的关键“守卫军”，肩负着吞噬病原体、调节免疫应答以及维持组织稳态诸多重任。通过原代提取的方式，研究人员能够绕开细胞系多次传代后可能出现的遗传特性改变、功能衰退这问题，直接从鲜活的生物体内精准抓取具备完整生物活性的巨噬细胞，为后续一系列实验奠定基础。

原代骨髓来源的巨噬细胞在未受到刺激时，通常呈圆形或椭圆形，其细胞大小不一，细胞核较小，多呈圆形或椭圆形，染色质疏松，有明显的核仁。细胞质中常见到空泡和颗粒状物质，这些结构与细胞的吞噬功能相关。

以下是以小鼠为例的巨噬细胞原代提取方法的详细步骤和注意事项：

实验材料准备

实验动物：C57BL/J小鼠

试剂：含10%FBS DMEM高糖培养基、75%乙醇、无菌PBS。

实验器械：一次性注射器、手术器械、离心管、细胞培养板或培养瓶

实验步骤

1、小鼠取腿骨

1）小鼠麻醉与处死：麻醉小鼠，迅速、人道地采用脱臼法处死，遵循动物实验伦理，减轻小鼠痛苦。

2）体表消毒：备好足量75%乙醇的烧杯，放入小鼠浸泡5min，充分消毒杀菌；随后用干净纸吸干体表多余酒精。

3）皮肤及关节处理：持消毒剪刀在小鼠背部剪一小口，徒手平稳撕开皮肤至小腿关节，剔除足关节与皮肤。

4）腿部取材、二次消毒：用消毒剪刀小心从大腿根部大转子处拆解后肢，避免骨折；剔除肌肉，将腿骨置于75%乙醇培养皿浸泡5min。

5）超净台准备：5min到点，更换新乙醇培养皿，移入超净台，为后续实验营造无菌条件。

2、BMDM细胞提取和诱导

1）腿骨预处理：将乙醇浸泡过的小鼠腿骨移至盛冷PBS的容器，浸没腿骨，用PBS洗去骨表面乙醇，重复3次，确保洗净。

2）骨髓吹出操作：分离洗净的股骨、胫骨，消毒剪剪断两端；用1mL注射器吸取冷诱导培养基，对准断端吹骨髓，反复吹洗约3次，至腿骨内无明显红色。

3）细胞分散与过滤筛选：用5mL移液枪轻柔吹打含骨髓细胞的培养基，分散细胞团块；悬液过70μm细胞滤器，滤除杂质，转移至15mL离心管。

4）离心及重悬处理：1500rpm/min离心5min，弃上清；加红细胞裂解液重悬，静置5min，再同转速离心5min，弃上清；用冷诱导培养基重悬细胞沉淀。

5）细胞培养及培养基更换：按要求铺板培养细胞，第三天换一半培养基，维持环境稳定；第五天全换新鲜培养基，满足细胞生长分化需求；第七天细胞达可用状态。

注意事项

1）BMDM细胞生物学特性特殊，不可传代。

2）胰酶消化常用于分离贴壁细胞，但不适用于BMDM细胞。因其蛋白水解活性会破坏细胞膜、关键蛋白，致使细胞失活，无法用于后续实验，切勿用胰酶处理。

3）因传代、胰酶消化受限，取用BMDM细胞建议用细胞刮刀刮。

4）BMDM细胞脆弱、对环境敏感，获取后宜直接铺板用于实验，尽量别换培养容器。更换易造成物理扰动，引发细胞碰撞、拉扯，损伤细胞，干扰实验结果。