一、原代细胞概述

指直接从活体组织或器官中分离并在体外培养的细胞，保留了与原组织相似的生物学特性和功能。这些细胞在培养中具有有限的增殖能力，但由于其高度的生理相关性，被广泛用于研究细胞生理、疾病机制以及药物筛选等领域。

二、原代细胞分离

将细胞从组织或器官中提取并进行体外培养的过程。具体步骤包括在无菌条件下获取目标组织，利用酶如胰蛋白酶或胶原酶进行消化，将组织分解成单个细胞悬液，然后通过离心和过滤等方法分离出细胞，最终在适当的培养条件下进行培养。

三、实验步骤（消化培养法）

1、在无菌条件下，首先取大约1cm³的待培养组织，放入平皿或烧杯中，经过多次用适量的Hanks溶液冲洗，去除血液残留和结缔组织。

2、用锋利的剪刀将组织块剪碎，得到约0.5mm × 1mm大小的小块，并用Hanks溶液进行冲洗，使组织块沉淀并弃去洗液。

3、将组织小块吸入预先装有无菌磁力搅拌子的锥形烧杯中，加入15~30ml的胰蛋白酶，然后用橡皮塞盖紧，并用锡箔封好，置于37°C培养箱内的电磁搅拌器上。

4、打开搅拌器，启动搅拌子，关闭培养箱，使胰蛋白酶或胶原酶开始消化。在消化过程中，用显微镜观察，检查细胞是否分散成单个。若大多数细胞已分散，立即加入适量的Hanks溶液，终止消化。通常需10~20分钟消化。

4、先用100μm不锈钢筛过滤，滤去未消化的组织块或大细胞团，然后用20μm不锈钢筛过滤。

5、将滤液进行低速离心5分钟（500转），吸除上清液，并用Hanks溶液洗涤2次，最后加入含血清的培养液，摇匀，制成细胞悬液。

6、用计数板计数，确定细胞悬液的浓度，通常以1×105~3×105个细胞接种于培养皿中并放入培养箱（37摄氏度5%CO2）。

四、注意事项

1、组织块在进行消化前需要进行2-3次漂洗，以去除组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。

2、漂洗可使用Hanks溶液或其他适当的缓冲溶液，将组织块置于漂洗液中，轻轻摇动或轻轻搅拌，使其中的离子和抑制物质充分溶解和排出，然后将漂洗液弃去，准备进行下一步的消化处理。

3、胰蛋白酶是一种由胰脏分泌的消化酶其主要功能是水解蛋白质，将复杂的蛋白质分解为较小的多肽和氨基酸，这有助于身体吸收和利用蛋白质。胰蛋白酶主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，从而使蛋白质水解。

4、胶原酶则是一种来源于细菌的酶，在消化系统中具有强大的胶原水解作用。胶原酶能够有效地分解胶原蛋白，因此在医学上常被用于消化纤维性组织、上皮组织甚至癌组织。

5、适当提高原代培养接种的细胞密度，为培养细胞提供更多与体内相似的细胞间相互作用，可大大提高原代培养细胞在体外的存活率。