摘 要： 建立了高效液相色谱法同时测定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷的含量。采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分离，以乙腈-0.2%（体积分数）磷酸溶液作为流动相进行梯度洗脱，流量为1.0 mL/min，检测波长分别为321 nm（白花前胡甲素、白花前胡乙素）、284 nm（橙皮苷），柱温为30 ℃，进样体积为5 μL。白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷3种成分的质量在各自范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 5。样品的平均回收率为96.90%～102.98%，测定结果的相对标准偏差为0.44%～0.90%（n=6）。该方法稳定性强、准确度高，可用于除痰止嗽丸的质量控制。

关键词： 高效液相色谱法； 除痰止嗽丸； 白花前胡甲素； 白花前胡乙素； 橙皮苷

 

除痰止嗽丸是由前胡、陈皮、白术、法半夏、桔梗、黄芩、六神曲等18味药物组成，具有清肺降火，除痰止嗽的功效[1]。成方制剂中前胡、陈皮均为君药，前胡具有降气止咳、疏散肺热的作用，白花前胡甲素和白花前胡乙素为其香豆素类有效成分[2-5]；陈皮理气化痰，橙皮苷为其黄酮类有效成分，具有抗炎、抗菌抗病毒等功效[6-9]。该药的现行标准为《中华人民共和国卫生部药品标准》中药成方制剂第2册(WS3-B-0365-90)，该质量标准仅对除痰止嗽丸进行性状和显微鉴别，未对方中任何药物进行定性鉴别或者定量测定，不利于对药材及制剂质量进行监测和控制。现有文献对除痰止嗽丸质量标准提升研究甚少，只涉及了除痰止嗽丸测定一种或者两种指标性成分(桔梗、前胡)的方法[10]，尚未查询到除痰止嗽丸中3种指标成分同时进行含量测定的文献。

笔者参考测定白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷的方法[11-16]，建立高效液相色谱法同时测定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷三种指标性成分的含量，为进一步提高除痰止嗽丸的质量标准提供参考。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：1260 Infinity II型，二极管阵列检测器，美国安捷伦科技有限公司。

电子天平：（1）BSA224S型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯仪器有限公司；（2）XPR105DR型，感量为0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司。

超声波清洗器：KQ-500DE型，昆山市超声仪器有限公司。

超纯水制备系统：Milli-Q IQ7000型，美国密理博仪器有限公司。

白花前胡甲素对照品：质量分数为99.4%，批号为111711-201904，中国食品药品检定研究院。

白花前胡乙素对照品：质量分数为99.7%，批号为111904-202105，中国食品药品检定研究院。

橙皮苷对照品：质量分数为97.2%，批号为110721-202220，中国食品药品检定研究院；

甲醇、乙腈：均为色谱纯，美国西格玛化学公司。

磷酸：色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司。

除痰止嗽丸样品：批号分别为20010706、20010566、20010110，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂。

除痰止嗽丸阴性样品：北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂。

实验用水均为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美国安捷伦科技有限公司)；柱温：30℃；检测波长：白花前胡甲素、白花前胡乙素为321 nm、橙皮苷为284 nm；进样体积：5 μL；流动相：A相为乙腈，B相为0.2%(体积分数)的磷酸水溶液，流量为1.0 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，梯度洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.3 溶液配制

1.3.1 混合对照品溶液

白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品储备溶液：取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品适量，精密称定，分别置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，摇匀。

白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷混合对照品溶液：取橙皮苷对照品适量，精密称定，置于50 mL容量瓶中，再分别取白花前胡甲素、白花前胡乙素对照品储备液1 mL加入容量瓶中，加入甲醇稀释定容至标线，制成白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷的质量浓度分别为63.02、32.52、282.27 μg/mL的混合对照品溶液。

1.3.2 样品溶液

取除痰止嗽丸样品适量，剪成小块，精密称取3 g左右，加适量硅藻土研细，置于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞后称定质量，超声处理(功率500 W，频率40 kHz) 20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减少质量，摇匀，滤过，作为样品溶液。同法制备不含前胡和陈皮的阴性样品溶液。

1.4 实验方法

分别取混合对照品溶液、样品溶液和阴性样品溶液，在1.2仪器工作条件下进样测定，记录各溶液色谱峰面积，绘制标准工作曲线，以外标法计算样品中白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷成分的含量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 色谱柱的选择

以乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相，分别考察了Waters Symmentry-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)和ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)对3种指标成分的分离效果和色谱峰形。结果表明，当使用ZORBAXSB-C18柱时，基线平稳、分离度好，色谱峰形对称，保留时间合适，因此选择ZORBAXSB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)作为分析柱。

2.2 检测波长的选择

采用二极管阵列检测器，在200～400 nm范围内扫描混合对照品溶液，结果表明，白花前胡甲素和白花前胡乙素两种成分在321 nm处吸收最大，橙皮苷在284 nm处吸收最大，结合分离度、色谱峰形、杂峰干扰等因素，将白花前胡甲素和白花前胡乙素的检测波长定为321 nm，橙皮苷的检测波长定为284 nm。

2.3 流动相的选择

考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液3种流动相体系，采用等度或梯度洗脱的方式，测定样品中3种指标性成分的含量。结果表明，使用上述3种流动相，色谱峰的峰形和分离度较差，保留时间较长；根据3种指标性成分的分子极性，通过梯度洗脱程序的优化，最终确定以乙腈-0.2%磷酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱，色谱图基线平稳，3种成分分离度良好，且保留时间适中。

2.4 样品处理条件的优化

分别考察了甲醇、50%甲醇水溶液、70%甲醇水溶液、三氯甲烷作为提取溶剂，超声处理30 min对白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷提取结果的影响，测定结果见表2。由表2可知，甲醇作为提取溶剂时提取效率最高，70%甲醇提取效率次之，而三氯甲烷不能有效提取3种成分，故选择甲醇作为提取溶剂。

表2   不同提取溶剂时3种成分的测定结果

Tab. 2   Results of determination of 3 components in different extraction solvents

 

以甲醇为提取溶剂，考察超声提取、加热回流两种方式对白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷3种成分的提取效果。结果表明，2种提取方式对除痰止嗽丸中3种成分测定结果无明显影响，综合考虑操作简单，杂质峰较少等因素，选择超声提取作为样品处理的方法。

以甲醇为提取溶剂，分别考察白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷3种成分在不同超声时间(20、30、45、60 min)的提取效果，结果见表3。由表3可知，超声20 min即可实现3种成分的有效提取，考虑到时间成本和提取效率，选择超声(500 W，40 kHz)时间为20 min。

表3   不同超声时间3种成分的测定结果

Tab. 3   Determination results of 3 components at different ultrasonic time

 

2.5 方法专属性

分别精密吸取5 μL对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液，在1.2色谱条件下进样测定。样品溶液、混合对照品溶液和阴性样品溶液色谱图如图1所示。

图1   样品溶液、混合对照品溶液和阴性样品溶液色谱图

Fig. 1   Chromatogram of sample solution，mixed control solution and negative sample solution

1—橙皮苷；2—白花前胡甲素；3—白花前胡乙素

 

从图1中可以看出，各色谱峰分离度良好，阴性样品溶液在白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷对照品相应色谱峰位置未检出色谱峰。表明本方法系统适用性及专属性均良好。

2.6 线性关系及检出限

分别精密吸取混合对照品溶液1、2、3、5、8 μL，在1.2色谱条件下进行测定，以进样质量(x)为横坐标、色谱峰面积(y)为纵坐标，绘制标准工作曲线，得到线性方程。将混合对照品溶液进行适当稀释，以3倍信噪比对应的质量浓度作为检出限，10倍信噪比对应的质量浓度作为定量限。3种成分质量浓度的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表4。

表4   3种成分的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 4   Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit of the three components

 

由表4可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷3种成分的质量在各自范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 5。

2.7 精密度试验

取同一批号除痰止嗽丸样品6份(批号为20010706)，按1.3.2制备样品溶液，在1.2色谱条件下进样测定，计算6份样品中待测成分的色谱峰面积平均值和相对标准偏差(RSD)，结果见表5。

表5   精密度试验结果

Tab. 5   Results of precision test

 

由表5可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷峰面积的RSD分别为0.99%，1.05%，1.01% (n=6)，表明方法具有良好的精密度。

2.8 稳定性试验

取新制备的一批样品溶液(批号为20010706)，于第0、2、4、6、8、10、12、24 h内在1.2色谱条件下进行稳定性试验，记录各组分色谱峰面积，稳定性试验结果见表6。

表6   稳定性试验结果

Tab. 6   Results of stability test

由表6可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷峰面积的RSD分别为0.33%、0.42%、0.52%，表明溶液稳定性在24 h内良好。

2.9 加标回收试验

精密称取各成分含量已知的同一批次样品(批号为20010706)，加入混合对照品溶液10 mL，按1.3.2方法，平行处理6份样品溶液，在1.2色谱条件下分别进行测定，计算加标回收率，结果见表7。

表7   加标回收试验结果

Tab. 7   Results of addition recovery test

 

由表7可知，白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷的平均回收率分别96.90%、102.98%、101.75%，表明该方法具有较高的准确度。

 

3. 结语

 

建立了高效液相法同时测定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素、橙皮苷3种成分含量，对色谱条件、样品处理条件等进行了优化。该方法操作便捷，专属性良好，精密度、稳定性、准确度均较高，可适用于除痰止嗽丸中3种成分含量的同时测定，为除痰止嗽丸的质量控制提供方法学参考。

 

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引用本文： 曹蓉蓉，张卫莲 . 高效液相色谱法同时测定除痰止嗽丸中白花前胡甲素、白花前胡乙素和橙皮苷［J］. 化学分析计量，2024，33（11）：74. (CAO Rongrong, ZHANG Weilian. Simultaneous determination of Praeruptorin A, Praeruptorin B and Hesperidin in Chutan Zhisou Pills by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 74.)