在实验室的分析工作中，液相色谱法无疑是科研人员手中的 “利器”。但当遇到极性化合物时，这把 “利器” 常常会 “失手”。别担心，今天就给大家带来一篇超实用的干货文章，让你轻松应对液相色谱分离极性化合物的难题！

一、反相色谱柱分离极性化合物的困境

反相色谱柱，如 C18 键合相柱，通常依靠分析物与烷烃链之间的疏水相互作用来分离物质。然而，对于有机酸 / 碱类化合物、多羟基化合物以及偶氮类等极性化合物，它们含有羧基、氨基、羟基等可解离部分，极性较大。在经典反相 C18 类键合相上进行分离时，会出现容量因子K 过小，导致化合物在死时间附近出峰的情况。

即使在梯度分析方法开发时，降低起始有机相比例，甚至以纯水相作为起始流动相，也难以有效保留这些极性化合物。而且，还会出现峰展宽、C18 色谱柱固定相孔内去湿现象（Dewetting），进而导致化合物保留时间减少、色谱峰峰形异常等问题，拖尾现象尤为常见。

二、孔内去湿现象大揭秘

反相 HPLC 一般以水为弱洗脱相，甲醇、乙腈等有机试剂为强洗脱相。在梯度洗脱过程中，有机相比例在 5% - 100% 范围内变化。对于极性化合物，即使有机相比例为 5%，也难以有效保留。当有机相比例进一步降低至 0% 时，就会引发色谱柱多孔内表面及固定键合相的去湿现象。

[图 1 反相 C18 键合相上孔内去湿现象]

如图所示，当有机相比例在 5% 及以上时，流动相可以轻松浸入固定相基质多孔内，浸湿内表面及 C18 烷烃链，C18 链呈自由伸展构象，能与样品组分的疏水部分良好相互作用，实现适当保留。而使用 100% 水相时，尽管可以增大色谱柱前段压力使纯水相浸入基质多孔内部，但无法有效浸湿内表面及 C18 链。由于色谱柱沿流动相流动方向的压力降现象，整个色谱柱的浸湿状态差异很大。当柱前压减小时，纯水相会被 “排出” 孔隙，导致去湿现象发生，如图 1 所示。

图2 反相色谱柱压力降

C18 链在孔内去湿现象发生前后的构象变化如图 3 所示。在典型反相 HPLC 流动相下（水相 ≤95%），C18 链呈自由伸展构象；而在 100% 水相下，C18 链相互 “交联”，靠近内表面，形成疏水屏蔽层，失去与待分离组分疏水部分相互作用的能力，导致保留时间变短。

[图 3 C18 链在孔内去湿现象发生前后]

三、极性化合物分离的挑战

在反相 C18 色谱柱上分析极性化合物时，常面临以下问题：

（一）保留时间过短

化合物本身或在体系中解离后极性过大，油 - 水分配系数过小，无法与疏水选择性基团发生足够相互作用，随起始流动相直接流出色谱柱。

图4 极性化合物

（二）色谱峰峰形拖尾

静电相互作用 ：有机酸类化合物在流动相 pH 大于其 pKa 时解离带负电，与硅胶基质上残留金属离子发生静电相互作用；有机碱类化合物在流动相 pH 小于其 pKa 时解离带正电，与弱酸性的硅羟基产生静电相互作用。

氢键相互作用 ：多羟基、羟基 - 胺类有机化合物以及未解离有机酸碱类化合物与硅羟基之间存在氢键相互作用。

溶剂选择不当 ：溶解极性化合物的溶剂不合适，也会导致色谱峰拖尾。

四、极性化合物分离策略全解析

（一）非封端短链烷烃键合固定相

这种色谱柱的特点是硅胶基质表面裸露的硅羟基不封端，键合固定相链长度小于 C8。由于固定相烷烃链长度短于 C18，多孔内疏水性减小，表面硅羟基不封端使纯水相与多孔接触角变小，相比典型 C18，孔内去湿现象可能性大大降低。同时，这种色谱柱在分离样品组分时，吸附作用及硅羟基氢键相互作用占主导地位。

（二）极性封端与极性增强型固定相

该色谱柱采用极性或亲水性封端试剂对表面裸露的硅羟基进行封端，C18 键合密度较低。与典型 C18 色谱柱相比，内表面水浸润性增加，孔内疏水性相对减小，允许使用 100% 水相。

（三）极性内嵌烷基固定相

这种色谱柱在长链烷基靠近硅胶内表面的一端，内嵌入甲酸酯基类、脲或酰胺基、硫酰胺基等极性改性官能团。极性内嵌使整个键合相亲水性增强，多孔内疏水性减小，在 100% 水相条件下，极性内嵌烷烃链保持自由伸展构象。此外，内嵌极性基团对表面裸露的硅羟基有屏蔽作用，减小极性化合物尤其是碱性化合物的拖尾因子，使色谱峰峰形更对称。

通过对色谱柱硅胶表面或烷烃链改性，如增加内表面极性大小及烷烃链内嵌极性官能团，可提高多孔内表面及固定相的水浸润能力，减少或避免孔内去湿现象。同时，调整 HPLC 操作方式及改变色谱条件，也能对极性化合物的保留因子及峰形进行优化。