一、蛋白质

蛋白质是由氨基酸以“脱水缩合”的方式组成的多肽链经过盘曲折叠形成的具有一定空间结构的物质。

蛋白质（protein）是生命的物质基础，是有机大分子，是构成细胞的基本有机物，是生命活动的主要承担者。氨基酸是蛋白质的基本组成单位。机体中的每一个细胞和所有重要组成部分都有蛋白质参与。人体内蛋白质的种类很多，性质、功能各异，但都是由20多种氨基酸（Amino acid）按不同比例组合而成的，并在体内不断进行代谢与更新。

蛋白质是由C（碳）、H（氢）、O（氧）、N（氮）组成，一般蛋白质可能还会含有P（磷）、S（硫）、Fe（铁）、Zn（锌）、Cu（铜）、B（硼）、Mn(锰)、I（碘）、Mo（钼）等。

这些元素在蛋白质中的组成百分比约为：碳50% 氢7% 氧23% 氮16% 硫0~3% 其他微量。

（1）一切蛋白质都含N元素，且各种蛋白质的含氮量很接近，平均为16%；

（2）蛋白质系数：任何生物样品中每1g元N的存在，就表示大约有100/16=6.25g蛋白质的存在， 6.25常称为蛋白质常数

二、检测方法

食品中蛋白质的测定方法主要有凯氏定氮法,双缩尿法（Biuret法）、Folin－酚试剂法（Lowry法）、紫外吸收法和考马斯亮蓝法（Bradford法）

1.凯氏定氮法【GB/T 5009.5—1985】

实验原理
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

2.双缩脲法（biuret法）

实验原理

双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。

紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、tris缓冲液和某些氨基酸等。

此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

3.folin―酚试剂法（lowry法）

实验原理

这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即folin―酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。folin―酚试剂中的磷钼酸盐―磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。

此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。

4.考马斯亮兰法（bradford法）

实验原理

双缩脲法（biuret法）和folin—酚试剂法（lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。

1976年由bradford建立的考马斯亮兰法（bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

在595nm下测定的吸光度值a595，与蛋白质浓度成正比。

bradford法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰lowry法的k+、Na+、mg2+离子、tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、edta等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、triton x-100、十二烷基硫酸钠（sds）和0.1n的NaOH。（如同0.1n的酸干扰lowary法一样）。

（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。

6.紫外吸收法

实验原理

蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。

紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。特别适用于柱层析洗脱液的快速连续检测，因为此时只需测定蛋白质浓度的变化，而不需知道其绝对值。

此法的特点是测定蛋白质含量的准确度较差，干扰物质多，在用标准曲线法测定蛋白质含量时，对那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差。故该法适于用测定与标准蛋白质氨基酸组成相似的蛋白质。若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法，加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。

此外，进行紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。

三、国家标准

1 GB/T 24897-2010 粮油检验 稻谷粗蛋白质含量测定 近红外法

2 GB/T 24899-2010 粮油检验 小麦粗蛋白质含量测定 近红外法
3 GB/T 24901-2010 粮油检验 玉米粗蛋白质含量测定 近红外法
4 GB/T 24870-2010 粮油检验 大豆粗蛋白质、粗脂肪含量的测定 近红外法
5 GB/T 24871-2010 粮油检验 小麦粉粗蛋白质含量测定 近红外法
6 GB 24788-2009 医用手套表面残余粉末、水抽提蛋白质限量
7 GB/T 24318-2009 杜马斯燃烧法测定饲料原料中总氮含量及粗蛋白质的计算
8 GB/T 2910.4-2009 纺织品 定量化学分析 第4部分：某些蛋白质纤维与某些其他纤维的混合物(次氯酸盐法)
9 GB/T 14489.2-2008 粮油检验 植物油料粗蛋白质的测定
10 GB/T 5511-2008 谷物和豆类 氮含量测定和粗蛋白质含量计算 凯氏法
11 GB/T 21870-2008 天然胶乳医用手套水抽提蛋白质的测定 改进Lowry法
12 GB/T 17811-2008 动物性蛋白质饲料胃蛋白酶消化率的测定 过滤法
13 GB/T 19495.8-2004 转基因产品检测 蛋白质检测方法
14 GB/T 18868-2002 饲料中水分、粗蛋白质、粗纤维、粗脂肪、赖氨酸、蛋氨酸快速测定 近红外光谱法