FDA关于ANDA强制降解试验的观点

强制降解试验为方法学验证中的重要内容，为了解国外对强制降解试验的要求，根据Pharmaceutical Technology 第36卷5期中“FDAPerspectives: Scientific Considerations of Forced DegradationStudies in ANDA Submissions”一文（发布时间为2012年5月2日，作者为Ragine Maheswaran），对FDA关于强制降解试验的相关要求进行了翻译整理，具体内容如下：

一、强制降解试验简介

强制降解试验也称破坏性试验，其试验目的明确。强制降解试验可预测原料药的稳定性或影响制剂的纯度、有效性和安全性的因素。了解不同破坏条件下药物的降解产物和降解途径是非常必要的。强制降解试验可以为分析方法的建立、说明书的制定和处方设计的确定等提供有益的参考。样品破坏的程度取决于药物本身的性质和产品的剂型。ICHQ1B为光稳定性试验提出了一些建议，在ICH稳定性指导原则和验证指南中，没有可以参考的关于其他降解条件的建议，对于氧化和水解降解研究也仅有有限的信息。原料药与辅料分析方面的药物专著可以为不同原料药的各降解条件提供参考。

二、仿制药强制降解试验研究存在的问题

仿制药申请时提供的强制降解试验研究数据不完整是申报的一大缺陷。美国仿制药申报常见缺陷解读（CMC部分）已经出版，常见的一些例子说明，强制降解试验的缺陷包括以下几个方面：

原料药在各破坏条件下均不产生降解。请重复破坏试验以获得足够的降解产物,若没有产生降解,请提供依据。

破坏条件过于剧烈，导致大部分药物均被降解。请用温和的破坏条件或减少样品暴露时间以产生相关的降解产物。

请注意即使你已经用含量测定的方法对破坏的样品进行了检测，为了验证有关物质的检测方法具有稳定性指示功能，破坏的样品也应用有关物质的方法进行测定。

请提供所做的验证试验数据，以证明用以检测未破坏样品和破坏样品的方法能够检测出所有的降解杂质。

请对破坏样品中已知和未知的降解产物进行列表总结。

请确定检测软件对峰纯度检测的峰高要求。

请说明破坏样品质量不守衡的理由。

请鉴别原料药与辅料相互作用产生的降解产物。

光稳定性研究表明药品对光敏感，请解释这一点是如何在分析方法，生产工艺以及药品运输过程反映出来的。

在仿制药申请中,尽量减少以上缺陷,通常会建议在申请过程中报告强制降解试验的相关信息。强制降解试验获取的信息能够为开发稳定性指示分析方法、生产工艺,产品运输和储存条件的确定提供依据。

三、如何进行强制降解试验

1、降解条件

典型的强制降解主要包括四种机制：高温、水解、氧化和光降解。

选择适当的破坏条件，如酸碱和氧化剂的浓度、破坏温度、适宜的破坏时间，以实现样品最佳降解程度。样品破坏过度会产生在药品稳定性研究过程中和正常破坏条件下均不会产生的二次降解产物，这并不是降解试验的目的。因此，控制样品降解达到预期水平是十分必要的。为了实现有目的的降解，应制定适宜的降解研究方案。同时为加速试验和长期试验的放置条件提供依据。通常认为样品降解量应在5~20%之间。对于含量限度为标示量的90%~110%的小分子药物，即使在文献中有更广泛的推荐范围作为参考（例如，10~30%），通常允许10%的降解量。降解试验破坏条件越剧烈，则越容易产生二级降解产物。

1.1光稳定性

光稳定性试验是强制降解试验的重要组成部分，对光敏感药物尤为重要。ICH Q1B指导原则提出了新原料药和制剂的光稳定性试验条件。原料药、固体/液体制剂,应暴露在总照度不低于1.2×106 Lux •hr,近紫外能量不低于200w•hr/ m2的条件下,相同样品应同时暴露在日光灯和近紫外灯下。可控制合适的温度以减少局部温度变化效应。光破坏样品要检查样品是否有物理性质(如外观、溶液的颜色或澄清度)、含量和降解产物的变化。Q1B中列出的决策树可以用来确定药物的光稳定性试验条件。产品标签应列出产品适宜储存条件,要注意仿制药标签应和参考上市药物标签以及美国药典(USP)相关建议(如适用)保持一致。

1.2热稳定性

热破坏试验条件（例如：干热破坏和湿热破）应比ICH Q1A中推荐的加速试验条件剧烈。固体原料药和制剂应同时暴露于干热和湿热条件下，而液体制剂可以暴露于干热条件下。建议破坏温度应高于加速试验温度的10℃，相对湿度为75%或者更高。破坏试验也可以在更高温度条件下进行短时间破坏。对破坏样品进行多个时间点检测，能够充分提供降解速率、一级与二级降解产物的信息。即使药物较稳定，产生较少降解产物或无降解产物产生,也应确保破坏强度高于在加速条件下（40℃）放置6个月的破坏强度。

1.3酸碱水解

原料药与制剂应在常温或更高温度条件下，以溶液状态进行酸碱水解破坏试验，酸碱种类和浓度的选择取决于药物本身的特点。其中一种酸碱破坏试验方案为样品于室温条件下放置，在不同pH条件下破坏两周，并且破坏程度建议应不高于15%。酸降解一般采用0.1mol/L-1.0mol/ L的盐酸或硫酸，碱降解采用0.1mol/L-1.0mol/ L的氢氧化钠或氢氧化钾溶液。对于脂溶性药物，可选择惰性溶剂溶解药物，在选择助溶剂时，应考虑药物分子中存在的官能团不与助溶剂发生反应。了解化合物的相关性质对于选择破坏条件是有用的，例如，一个化合物含有酯基，则它对碱是不稳定的，则可选择较低浓度的碱进行破坏，在不同时间点对样品进行测定，能够了解降解速率和区分一级、二级降解产物。

1.4氧化破坏

氧化破坏试验相对较复杂，过氧化氢应用较广泛，因为能够用它来模拟辅料中可能含有的过氧化物，其他氧化剂，如金属离子，氧气，以及自由基引发剂（例如，偶氮二异丁腈，AIBN）也可以应用。氧化剂种类和浓度的选择取决于药物本身的性质。原料药在溶液状态下，制剂在溶液或固体状态下进行氧化破坏。据报道,样品放置于室温,在中性条件下经浓度为0.1%到3%的过氧化氢破坏7天,最多能产生20%的降解产物。在不同时间点对样品进行测定,以选择所需的降解水平,不同的降解条件会产生相同或不同的降解产物,降解的类型和程度取决于样品的官能团和降解条件。

2、分析方法

2.1试验方法

首选检测方法是反相高效液相色谱法，原因如下：与水和有机溶剂具体良好的相容性，准确度好，灵敏度高，能够检测极性化合物。通过选择合适的色谱柱、柱温，调节流动相的pH值，从而达到各峰的分离。低保留，极性较大的杂质会在溶剂峰前出峰。梯度洗脱作为分析方法的一部分，流动相中有机相比例由低到高过度，能够检测出低保留极性化合物和高度保留的非极性化合物。也可以用梯度方法对破坏样品进行检测,来评估目前的洗脱方法是否能够对样品进行有效的检测,选择的样品溶液和流动相应能充分反映和检测出药物本身、潜在杂质和降解产物。破坏样品的制备方法应尽可能地模拟分析过程中所用的样品制备方法。对酸碱破坏样品溶液进行酸碱中和稀释是必要的。破坏样品的图谱应与空白溶液和未破坏样品的图谱进行对比，从而确定各降解产物的降解途径。计算杂质含量时,应扣除空白峰,空白,未破坏样品和破坏样品的图谱均应显示所有的已知和未知杂质的含量。另外,手性化合物应该用手性分析手段来确定手性化合物的纯度和稳定性。分析方法应有足够的灵敏度以检测出较低水平的杂质，（例如，应检测出0.05%浓度的杂质或者更低浓度的杂质），并且峰响应值应在线性范围内的峰响应值以下。分析方法应能检测到稳定性研究过程中产生的所有杂质(浓度为报告限度浓度或更低),依据ICH的要求和稳定性研究结果，来决定降解产物是否应该被鉴定和界定。常规检测方法(例如柱色谱法)或联用技术(例如,LC–MS,LC–NMR)均可应用于降解产物的鉴别和界定。通过使用这些技术可以更深入的了解杂质结构,以及了解各杂质是否存在基因毒性警示结构,并对这些杂质进行严格的控制。

还应注意的是，对在稳定性研究过程中产生的超过界定阈值限度的杂质应进行界定。可以用不同的检测方法对各破坏样品进行检测(例如,紫外和质谱),所用的检测器应具有三维数据分析的能力,例如,二极管阵列检测器或质谱分析能够检测到光谱的非均匀性。当主峰和杂质峰紫外吸收图谱相似或者系统噪音水平过高从而掩盖了杂质或降解产物时,二极管阵列检测器可进行多波长检测。具有相同分子量和官能团的化合物(例如非对映异构体)会呈现出相似的紫外吸收图谱。这种情况下,需要改变色谱参数以实现色谱峰的分离。应选定最佳波长来检测和定量潜在杂质和降解杂质。如果被分析物、杂质和降解产物紫外吸收没有重叠，则应对样品进行多波长检测。在方法开发时，应对汇总不同检测波长下杂质的信息以发现峰值分布的异同。

2.2峰纯度检测

峰纯度是一种方法开发的辅助工具，当不同化合物共同洗脱时，依据化合物的光谱特性来反映峰纯度指标。未破坏样品和破坏样品的峰纯度或峰均匀性是根据二极管阵列检测器的光谱信息确立的。用于确定峰光谱纯度的仪器软件，相关参数应按照生产厂商的说明书进行设置，并确定峰纯度检测时对色谱峰峰高的要求。因为吸光度值过大，紫外检测呈非线性，应同时设置仪器阈值，以确保共洗脱峰均能被检出，并选择参比光谱的最佳位置。在梯度洗脱过程中，应验证软件自动校正不断变化的溶剂峰的能力。峰纯度检测不是确定检测峰是否为纯峰的绝对证明，当共洗脱峰光谱相似、样品浓度低于检测限浓度、检测峰没有发色团，或者样品没有溶解的情况下，峰纯度检测具有一定的局限性。

2.3质量守衡

尽管不是在所有的情况下，破坏样品均能达到质量平衡,但这种方法能使稳定性指示方法更加充分。此法可以通过样品测量值、所有杂质和降解产物的测量值之和与未破坏样品初始值接近100%的程度来确定，在计算时适当考虑产生的分析误差。尽量使所有的破坏样品均达到质量守衡。若样品质量不守衡，则应进行深入研究，并对这种情况给出说明。由于被分析物和杂质紫外吸收情况有显著差异，应用外标法对样品进行检测。挥发性杂质的潜在损失、非紫外吸收化合物的形成，不保留杂质，强保留杂质等情况都应被考虑在内。交替检测技术，例如示差折光检测器与液质联用可以用来检测非紫外吸收的降解产物。

3、研究终点

确保样品在各降解条件下进行充分的暴露后即可终止强制降解试验，药物分子典型活化能从12 kcal/mol变换到24kcal/mol。一种化合物不一定在每种降解条件下均产生降解，暴露极值的一般准则可参考相关文献。一些稳定药物在任意降解条件下均不会产生降解，可以通过在药物中加入已知杂质来建立分析方法，同时应保证各峰能够达到基线分离。

另，在使用药典和USP <621>中概述的限制使用的方法,降解试验是没有必要研究的。因为同一药物的不同晶型可能具有不同的稳定性特征，当一个仿制药产品晶型不同于RLD产品晶型时，原料药应进行降解试验来评价多晶性药物的理化变化。

四、相关说明

在QbD理念中,研究关键质量属性满足预定目标的产品,必须运用强制降解试验中获得的数据信息。在QbD理念中，一个精心设计的强制降解试验研究对于分析方法的开发是不可或缺的，它有助于建立一个稳定的特异性指示方法和预测在稳定性研究中可能形成的潜在降解产物。将所有潜在杂质混合进行分析方法的建立，并且通过建立各峰峰纯度的理念来帮助避免不必要的方法再开发和再验证。药物在各降解条件下的化学变化，为制剂处方筛选提供有用的信息。辅料相容性试验的目的是了解药物研发过程中，处方中各成分的相互作用，它是药物研发过程中不可或缺的一部分。分别对原料药、制剂与参比制剂进行强制降解试验和杂质分布对比，药物与辅料相互作用或者复方中药物和药物的相互作用而产生的降解杂质是可以考察的。从中获得的药物相关峰与药物非相关峰的信息则可应用于更稳定的制剂处方的选择和研究。例如，如果一种药物对氧敏感,需考虑在处方中加入抗氧剂;如果药物本身对酸不稳定,或者在酸性介质中会转换成其他物质，那么将这种药物做成缓释制剂可能是必要的。酸碱水解破坏试验可以为药品制成液体制剂或混悬溶液制剂提供参考依据。在强制降解试验研究中获得的信息可以促进生产工艺过程的改进，如果光稳定性试验研究显示药物对光敏感，那么在药品生产过程中就应注意这点。原料药和制剂热破坏性试验可以为工艺开发提供有用的信息（例如，湿法制粒还是干法制粒，以及温度的选择）。此外，提高降解产物和降解机制的科学认知可能有助于确定导致稳定性试验失败的因素,如环境温度，湿度和光。选择合适的包装材料可以避免这些因素的影响。

总之，降解试验的合理设计与制药行业中正在推广的QbD理念是相吻合的。在药物开发研究前，一个精心设计的降解试验研究可为产品处方组成的选择提供依据。对药品降解途径与降解机制的认知，是QbD理念中分析方法开发的基础，同时也对制定产品在货架期的可接受标准至关重要。强制降解试验可提供药物的物理、化学稳定性方面的信息，为包材、存储条件的选择提供依据。仿制药产品在配方组成、生产工艺、工艺参数和包装材料方面与原研参比制剂存在差异,因此进行强制降解试验是非常必要的。