层析柱是层析技术中的主体，一般用玻璃管或有机玻璃管。根据样品混合物中各组分在固定相和流动相中分配系数不同，从而分离的一种层析法。选柱子：有玻璃柱和不锈钢柱两种，实验室常用玻璃柱。径高比一般在1:5-10。 根据吸附剂用量（体积)确定柱子大小，一般吸附剂应填充到柱子体积的1/4-1/5。

灌柱子方法

柱子可以分为：加压，常压，减压。 

压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。 

减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结)，以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长)。 

加压柱是种比较好的方法，与常压柱类似，只是外加压力使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或小气泵。特别在容易分解的样品的分离中适用。压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。 

柱子的尺寸为粗长的最好。柱子越长，相应的塔板数就越高。柱子越，上样后样品的原点就越小（反映在柱子上就是样品层比较薄)，这样相对的减小了分离的难度。 

无水无氧柱适用于对氧、水敏感，易分解的产品。可以湿柱，也可以干柱。不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能使产品分解，毕竟要分离的是敏感的物质，小心不为过。因为分离的物质比较敏感，所以接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk操作。至于是加压、常压、减压，随需而定。因为是schlenk操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点板，直接看柱子上的色带就行了。如果样品无色，只好准备几十个schlenk瓶，一瓶一瓶的点，不过几次之后就知道样品在哪，也就可以省些了。 

无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相。因为硅胶中有大量的羟基裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物。而氧化铝有碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但比硅胶要贵些。听说有个方法，就是用石英做柱子，然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过。

选择吸附剂：200-300目硅胶，称30-70倍于上样量；如果极难分，也可以用100倍量的硅胶。干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯量100ml也可以。 

推荐硅胶量是样品量的30-40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂质分的比较开(是指在所需组分Rf在0.2-0.4，杂质相差0.1以上)，就可以少用硅胶。 

用硅胶作固定相过柱子的原理是一个吸附与解吸的平衡。所以如果样品与硅胶的吸附比较强的话，就不容易流出。这样就会发生，后面的点先出，而前面的点后出。这时可以采用氧化铝作固定相。 

常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁)、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。 

几种常见吸附剂的特性  

（1)氧化铝：市售层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三类，粒度规格大多为100-150目。 

碱性氧化铝（pH9—10)：适用于碱性物质（如胺、生物碱)和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等)，也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。 

酸性氧化铝（pH3.5—4.5)：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。 

中性氧化铝（pH7—7.5)：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。

（2)硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。 

适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，及一系列合成产品如有机金属化合物等。

（3)聚酰胺：色谱用聚酰胺主要有锦纶6（聚己内酰胺)和锦纶66（聚己二酰己二胺)两种，分子量一般在16000-20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。

可溶于浓盐酸、甲酸及热的乙酸、甲酰胺和二甲基甲酰胺中；微溶于乙酸和苯酚等；不溶于醇、氯仿、丙酮、乙醚、苯等；对碱稳定，对强酸可水解。 

聚酰胺色谱的原理：兼具吸附色谱和分配色谱的功能。

采用强极性洗脱剂时主要为吸附色谱——正相色谱；

采用弱极性洗脱剂时主要为分配色谱——反相色谱。 

分离对象：能与聚酰胺形成氢键的化合物，如酚类、酸类、醌类、硝基化合物及含羟基、氨基、亚氨基的化合物及腈和醛等类化合物。 

聚酰胺在水中吸附能力的规律： 

形成氢键的基团(如酚经基、按基、酪基、硝基等)越多，吸附力越强。如丁二酸＞丁酸 形成氢键的位置与吸附力有很大关系。对位、间位酚羟基使吸附力增大，邻位使吸附力减小。芳香核、共轭双键多者吸附力大，少者吸附力小。若形成分子内氢键，则使化合物的吸附力减小。 

（4)硅酸镁：中性硅酸镁的吸附特性介于氧化铝和硅胶之间，主要用于分离甾体化合物和某些糖类衍生物。为了得到中性硅酸镁，用前先用稀盐酸，然后用醋酸洗涤，最后用甲醇和蒸馏水彻底洗涤至中性。

装柱子的技巧

柱层析的装柱非常重要，装柱的效果会直接影响层析分离效果。有湿法装柱和干法装柱等两种方法。湿法装柱很简单，使用也最普遍， 就是先用比固定相多一倍的洗脱剂将固定相活成匀浆，柱子底部先用脱脂棉塞紧， 然后倒入洗脱剂将脱脂棉中气泡赶出。

用漏斗将活好的固定相倒入柱子中， 打开底部活塞， 将柱子中高出固定相的溶剂放出。期间不断用橡皮棒敲打， 将固定相敲实， 做到密实均匀无气泡即可。

很多时候用加压的方法可以很高效地装好柱子，而且在柱子中没有气泡产生。

干法装柱与湿法装柱刚好相反的是，它是将干燥的吸附剂从柱子上端直接加入到一个空的柱子中， 然后用油泵抽柱子底部， 相当于减压过柱， 直到柱子变得很结实， 再用淋洗剂“走柱子” 。

干法装柱的一个缺点就是在装入洗脱剂后， 由于溶剂和固定相之间的吸附放热， 所以柱子容易变花，影响分离效果。

解决的方法是：

（1）固定相一定要添加结实；

（2）一定要用较多的溶剂“走柱子”，直到柱子的下端不再发烫， 恢复到室温后再撤去压力。无论使用哪种方法装柱，最后都要求所装的柱子结实、匀称、无气泡。

上样的技巧

上样也有湿法和干法之分：湿法一般用淋洗剂溶解样品， 也可以用二氯甲烷、 乙酸乙酯等， 但溶剂越少越好。再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁缓慢地均匀加入。

在不用海沙的情况下， 尽量不要破坏硅胶面。加样后， 打开柱底活塞， 让固定相充分地吸附所加样品。然后再加入一些洗脱剂，再充分地吸附后将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面。

然后就可以放心地加入大量洗脱剂， 而不会冲坏硅胶表面。很多样品在上柱前是粘乎乎的， 一般没关系。有的时候上样后在硅胶上又会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现， 是因为硅胶对样品的吸附饱和， 而样品本身又是比较好的固体才会析出， 这就需要先重结晶样品， 得到大部分的产品后剩余的产品再柱分。

如果不能重结晶也没关系，直接过柱就行， 样品会随着淋洗剂流动而慢慢溶解， 最后随着洗脱剂流出。有些样品溶解性差，能溶解的溶剂又不能上柱（比如 DMF，DMSO等， 会随着溶剂一起走， 显色是一个很长的脱尾） ， 这时就必须用干法上柱了。

 干法过柱是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，在加入少量硅胶， 拌匀后再旋去溶剂。一般样品和硅胶按 1：1 的量混合， 硅胶使用的量也可以少一些， 但是要保证在旋干后， 不能看到明显的固体颗粒，让样品都吸附在硅胶的表面上。然后小心地加入到装好的柱子中， 加入洗脱剂洗脱。

过柱的技巧

柱层析按过柱时的压力可以分为：加压， 常压， 减压。压力可以增加淋洗剂的流动速度， 减少产品收集的时间， 但是会减低柱子的塔板数。所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的， 但是时间也最长， 例如一些天然化合物的分离，有时一个柱子过几个月也有可能。

减压柱能够减少硅胶的使用量，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发， 有时会在柱子外面有水汽凝结， 另外有些比较易分解的东西可能得不到， 而且还必须同时使用水泵抽气， 噪音大， 时间长， 所以减压过柱用得比较少。

加压过柱是一种比较好的方法， 与常压柱类似， 但用外加压力可以使淋洗剂走的快些。压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵 （用鱼缸供气的加压泵就行）。特别是在容易分解的样品的分离中很适用。

一般压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。因为加压过柱效率高， 分离效果较好， 所以加压过柱在普通的有机化合物的分离中是非常适用的。

一些低沸点溶剂装柱时往往会在柱子中产生气泡， 使柱子变花， 利用加压过柱法在装柱时就可以有效地解决这个问题， 而且可以使柱子很快装实。

随着科技的发展， 色谱法的技术也日新月异， 但柱层析实验技术还是比较简单和实用的， 每个科研工作者在使用柱层析时， 可以根据自己的实际情况来不断地摸索，不断地总结和提高柱层析的实验技术。