实验原理：

Dot blot是一种半定量的蛋白质或核酸检测方法，其原理是将待测物直接滴于固相载体上，然后通过特异性抗体或探针与待测物结合，最终通过可视化方法来检测目标分子的存在与否。

溶液配置：

操作步骤：

（1）减取适当大小的PVDF膜，于甲醇活化1分钟。

（2）将活化后的PVDF膜于ddH2O中，在脱色摇床上清洗15分钟。

（3）提前预冷离心机，将样品在4℃低温条件下8000 rpm离心15分钟，取上清作为样品（分泌型蛋白）。

（4）取出活化后的PVDF膜在室温晾至半干，看见水膜消失即可。将收集的上清、空白对照、阳性对照分别取5 μl点样至PVDF膜上，风干。室温待样品吸收，样品吸收后点样处颜色加深。

（5）封闭：待PVDF膜上样品完全干燥后，于含5%脱脂奶粉的TBST溶液中封闭，37℃培养箱孵育2h或者4℃过夜孵育。

（6）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分钟。

（7）一抗孵育：用含5%脱脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀释比稀释一抗，37℃培养箱孵育2h或4℃过夜孵育。

（8）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分钟。

（9）二抗孵育：用含5%脱脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀释比稀释二抗，37℃培养箱孵育1.5 h。

（10）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分钟。

（11）曝光：用滤纸吸干PVDF膜上的TBST溶液，滴加ECL超敏显色剂（A液：B液=1：1），提前将化学曝光仪预冷，进行曝光，观察并记录结果。

图1. Dot Bolt鉴定分泌型蛋白表达

注意事项：

（1）在整个操作过程中，手不能直接接触PVDF膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解。

（2）脱脂奶粉封闭一定要充分，否则容易造成膜与蛋白的非特异性结合，膜上会出现杂点或假阳性，干扰试验结果。

（3）一抗浓度与二抗浓度不宜过高，否则容易造成高背景或者杂点。适宜浓度的选择，可以通过不同浓度组合的预试验进行确定。

（4）曝光时，时间的确定应该具体情况具体分析，需要一定的实践经验积累。

（5）ECL超敏发光液需要现配现用。

参考资料：

https://technologyinscience.blogspot.com/2019/06/dot-blot-technique-principle-procedure.html