蛋白提取是WB实验的前期工作，也是WB实验成功的关键。如何避免蛋白分解，有效地提取蛋白显得尤其重要。以下介绍两种全蛋白提取方法以及相关的注意事项：

方法1

1、细胞准备：准备近乎长满的细胞，此处以10cm大皿为例；

2、清洗：用预冷的PBS清洗大皿中细胞1-2次，并弃去PBS；

3、收集细胞：加入1mL PBS，用细胞刮刀刮取细胞，慢慢旋转刮取，来回刮2-3次，不留空白，并移至EP管中，常温1200rpm，离心5min，并弃去PBS；

4、裂解液配制：按照RIPA裂解液（强）：PMSF=100：1，加入400μL RIPA/皿和4μL PMSF/皿，若为磷酸化蛋白，则需加入磷酸酶抑制剂，比例为RIPA裂解液（强）：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1，并置于4℃；

5、裂解细胞：将上述配制好的裂解液加入步骤3 中EP管，4℃裂解15min；

6、超声破碎：将上述裂解后的细胞用细胞超声破碎仪破碎1-2min，功率为20-30%，保持4℃；

7、离心：超声破碎后，4℃，12000rpm离心15min;

8、蛋白变性：吸取7中的上清液至新的EP管中，并按蛋白液：5x loading buffer=4：1，加入适量的5x loading buffer，金属浴100℃，10min；

9、存放：将变性后的蛋白存至-80℃冰箱。

方法2

1、细胞准备：准备近乎长满的细胞，此处以10cm大皿为例；

2、清洗：用预冷的PBS清洗大皿中细胞1-2次，并弃去PBS；

3、裂解液配制：按照PBS：5X loading buffer =4：1配制裂解液，按照裂解液：PMSF=100：1加入PMSF，若为磷酸化蛋白，则需加入磷酸酶抑制剂，比例为裂解液：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1，并置于4℃；

4、裂解细胞：将上述配制好的裂解液加入大皿中，4℃裂解15min；

5、收集：用细胞刮刀刮取细胞，慢慢旋转刮取，来回刮2-3次，不留空白，并移至EP管中；

6、蛋白变性：吸取7中的上清液至新的EP管中，并按蛋白液：5x loading buffer=4：1，加入适量的5x loading buffer，金属浴100℃，10min；

7、存放：将变性后的蛋白存至-80℃冰箱。

常见问题解析

1、开始裂解至变性前，须保持4℃，以免蛋白降解；

2、加入裂解液至EP管时，可缓慢吹打混匀细胞，以裂解充分；

3、若裂解后仍然较为粘稠 ，可适当增加裂解液；

4、蛋白常见的保存温度为-20℃或-80℃。-20℃可较好地保护蛋白质的活性和稳定性。在这种温度下，蛋白质提取液可以较长时间保存，一般能保持数月至一年左右的稳定性。-80℃蛋白质的降解和变性速度更慢，可以更长时间地保持蛋白质的完整性和活性，可以长期保持数年至十年的稳定性；

5、保存蛋白质提取液时，应避免频繁的温度波动和反复冻融，这可能会对蛋白质的稳定性产生影响；

6、尽量避免用胰酶消化细胞，因为胰酶可能会影响到需要提取的目的蛋白，尤其是膜蛋白；

7、细胞不可生长过满，否则影响细胞状态乃至蛋白的表达。