气相色谱方法开发与验证_检测资讯

气相色谱方法开发与验证

嘉峪检测网 2025-02-25 11:52

气相色谱（GC）作为一种高效、灵敏的分离分析技术，已广泛应用于环境监测、食品安全、药物分析等领域。要建立可靠的气相色谱分析方法，需要进行系统化的步骤设计和严格的验证过程。今天，将与大家探讨气相色谱方法的建立与验证流程。

1.气相色谱方法开发流程

方法开发就是针对一个或一批样品建立一套完整的分析方法。就气相色谱而言，首先确定样品预处理方法；然后优化分离条件，直至达到满意的分离结果；最后建立数据处理方法包括定性鉴定和定量测定。当然，这一方法要真正成为实用方法，还必须进行验证。

图1.GC方法开发一般步骤

气相色谱方法的开发步骤包括样品的预处理、仪器配置的选择、初始操作条件的设定、分离条件的优化以及定性和定量分析的方法等，详细如下。

1.样品的来源与预处理方法

（1）样品的类型

气相色谱能直接分析的样品必须是气体或液体，固体样品必须溶解在适当的溶剂中，而且还要保证样品中不含气相色谱不能分析的组分（如无机盐）或可能损害色谱柱的组分。在接到未知样品时，需先了解其来源，从而推测样品中可能含有的组分及沸点范围。如果样品可以直接分析，只需找到合适的溶剂，如丙酮、己烷、氯仿、苯等GC常用溶剂。一般而言，溶剂应具有较低的沸点，便于与样品分离。尽量避免使用水、二氯甲烷、甲醇等溶剂，因为这些溶剂可能缩短色谱柱的使用寿命。此外，若使用毛细管柱，样品浓度不宜过高，以免色谱柱超载。

（2）样品的前处理

如果样品中有不能用气相色谱分析的组分，或者样品浓度太低、浓度太高等，这就要进行必要的预处理，如各种萃取、浓缩、稀释、提纯等方法。

（3）样品浓度

为了避免超载，我们应保持样品浓度在1000ppm以下。

无论是预处理还是气相色谱分析条件，文献查找都是重要的方法开发步骤。在开始实验之前，应该先查文献。若文献中已有相同样品的分析方法，可在此基础上优化实验条件，从而加快方法开发的进程。即使只能找到类似样品的分析方法，也可作为重要参考，避免走不必要的弯路。

2.仪器配置的选择

仪器配置就是用于分析样品的方法采用什么进样装置、什么载气、什么色谱柱以及什么检测器。比如，要用GC分析菊花的挥发性成分，就需要一个顶空进样器；要测定蔬菜中痕量含氯农药的残留量，就要用电子捕获检测器。就色谱柱而言，常用的固定相有非极性的OV-1（SE-30）、弱极性的SE-54、极性的OV-17和PEG-20M等。可根据极性相似相溶原理来选用，即分离一般脂肪烃类（如柴油或汽油）时多用OV-1（SE-30），分析醇类和酯类（如含酒精饮料）多用PEG-20M，分析农药残留量则多用OV-17或OV-1701。而要分析特殊的样品，如手性异构体就需要用到手型柱。对于很复杂的混合物，SE-54往往是首选的固定相。

3.初始操作条件设定

当样品准备好，且仪器配置确定之后，就可开始进行尝试性分离。这时要确定初始分离条件，主要包括进样量、进样口温度、色谱柱温度、检测器温度和载气流速等。

（1）进样量

要根据样品浓度、色谱柱容量和检测器灵敏度来确定。样品浓度不超过10mg/ml时填充柱的进样量通常为1~5μL，而对于毛细管柱，若分流比为50:1时，进样量一般不超过2μL。如果这样的进样量不能满足检测器的灵敏度要求时，可考虑加大进样量，但以不超载为限。必要时先对样品进行预浓缩，还可考虑采用专门的进样技术，如大体积进样，还可采用灵敏度更高的检测器。

（2）进样口温度

主要由样品的沸点范围决定，还要考虑色谱柱的使用温度，既要保证样品全部汽化，还要保证汽化的样品组分能够全部流出色谱柱，而不会在柱中冷凝。原则上讲，进样口温度高一些有利，一般要接近样品中沸点最高的组分的沸点，但要低于易分解组分的分解温度，常用的条件是250~350℃。大多数先进气相色谱分析仪的进样口温度均可达到450℃，这时，沸点为500℃左右的组分均可汽化（因为混合物在溶液状态下，组分的沸点会降低一些，而且样品的汽化是在流动的载气中进行的）。实际操作中，进样口温度可在一定范围内设定，只要保证样品完全汽化即可，而不必进行很精确的优化。注意，当样品中某些组分会在高温下分解时，就要适当降低汽化温度。必要时可采用冷柱头上进样或程序升温汽化（PTV）进样技术。

（3）色谱柱温度

主要由样品的复杂程度和汽化温度决定。原则是既要保证待测物的完全分离，又要保证所有组分流出色谱柱，且分析时间越短越好。组成简单的样品最好用恒温分析，这样分析周期会短一些。特别是采用填充柱时，恒温分析时色谱图的基线要比程序升温稳定得多。对于组成复杂的样品，常需要用程序升温分离，因为在恒温条件下，如果柱温较低，则低沸点分离得好，而高沸点组分的流出时间会太久，造成峰展宽，甚至滞留在色谱柱中造成污染；反之，当柱温太高时，低沸点组分又难以分离。毛细管柱的一个最大优点就是可在较宽的温度范围内操作，这样既保证了待测组分的良好分离，又能实现尽可能短的分析时间。

色谱柱的初始温度应接近样品中最轻组分的沸点，而最终温度则取决于最重组分的沸点。升温速率则要依样品的复杂程度而定。

（4）检测器的温度

是指检测器加热温度，而不是实际检测点，如火焰的温度。检测器温度的设置原则是保证流出色谱柱的组分不会冷凝，同时满足检测器灵敏度的要求。大部分检测器的灵敏度受温度影响不大，故检测器温度可参照色谱柱的最高温度设定，而不必精确优化。

（5）载气流速的确定

开始可按照比最佳流速（以填充柱为例：氮气约为20cm/s，氦气约为25cm/s，氢气约为30cm/s）高10%来设定，然后再根据分离情况进行调节。原则是既保证待测物的完全分离，又要保证尽可能短的分析时间。用填充柱时，载气流速一般设为30cm/s。

此外，当所有检测器需要燃烧气或辅助气时，还要设定这些气体的流量。有关检测器的说明书通常会列出适合的气体流量，可供参考，如用毛细管柱和FID时，检测器气体流量可设定为：空气，300~400mL/min；氢气，30~40ml/min；氮气（尾吹气）30~40ml/min。必要时可根据分析结果作进一步的优化。

(6)进样方式的选择

液体进样一般采用1μL、10μL或50μL微量注射器，用手动方式，插人进样器至针底部，快速注射并快速拔出注射器。或采用仪器配置的自动进样器进样，手动进样偏差为±(5%~10%)，自动进样为±2%。大量重复气体分析应采用六通阀手动或自动定体积进样，进样阀一般装在进样器前端。也可以用气密性注射简手动进样，但进样重现性较差。

以上初始条件设定后，便可进行样品的尝试性分析。一般先分离标准样品，然后分析实际样品，在此过程中，还要根据分离情况不断进行条件优化。

4.分离条件优化

分离优化是一个很大的题目，有专门的优化理论来研究，市场上还有计算机软件可用于优化。在这里我们只讨论操作条件、柱温和载气流速的优化。事实上，当样品和仪器配置确定后，我们除了可更换色谱柱外，还可改变柱温和载气流速，以期达到最优化的分离。柱温对分离结果的影响要比载气的影响大。

简单地说，分离条件的优化目的就是要在最短的分析时间达到符合要求的分离结果。所以，当在初始条件下样品中难分离物质的分离度R大于1.5时，可采用增大载气流速、提高柱温或升温速率的措施来缩短分析时间，反之亦然。比较难的问题是确定谱图中的峰是否为单一组分的峰，这可用标准样品对照，也可用GC-MS测定峰纯度。如果某一感兴趣的峰是两个以上组分的共流出峰，优化分离的任务就比较艰巨了。在改变柱温和载气流速都无法达到基线分离的目的时，就应考虑是更换更长的色谱柱还是更换不同固定相的色谱柱，因为在气相色谱中，色谱柱是分离成败的关键。

影响峰展宽的因素：理想情况下，经色谱分离的峰应当为高斯分布曲线，即对称峰。但实际上当一个样品谱带沿着色谱柱前进时，由于浓度差等原因，样品分析会向谱带两侧扩散，从而使色谱柱出口处的样品谱带比柱入口处宽，且可能产生不对称的峰，这就是谱带展宽。谱带展宽的程度主要用柱效来表示，色谱峰越对称，峰越窄，柱效就越高。

影响谱带展宽的因素很多，但不外乎柱内和柱外两类。柱内因素是指色谱柱本身的性能，如柱活性大小、固定相是否与样品发生化学反应、柱效是否足够高、样品是否超载等。柱外因素则主要指接头的死体积、进样口和检测器死体积等。在气相色谱中，柱外因素导致谱带展宽的程度要比柱内因素小得多。

5.定性与定量分析

（1）定性分析

是鉴定试样中的各组分，即每个色谱峰是何种化合物。基于气相色谱分离的主要定性依据是保留值，包括保留时间、保留指数等，也可以根据检测器给出选择性响应信号或与其他仪器联用定性。

① 保留值定性

最常用的方法就是通过标准物质对照来定性，在相同的色谱条件下，分别注射标准样品和实际样品，根据保留值即可确定色谱图上哪个峰是要分析的组分。定性时需要注意的是，在一定的色谱条件下，每个化合物具有一定的保留值，但是不同的化合物可能具有相同的保留值。按保留值确定试样中不存在某个化合物一般是可靠的，而较准确鉴定一个色谱峰是某个化合物，常需要改变色谱条件，通常是在两个不同的色谱柱上定性，称为双柱体系定性。

② 检测器选择性定性

气相色谱检测器一般有通用型和选择型两种，前者对所有化合物均有响应，后者只对某些类型的化合物有响应。如TCD为通用型检测器，而FID只对有机化合物有响应，根据TCD和FID有无响应，可鉴别试样中有机物和无机物。

③ 与其他仪器联用定性

红外光谱、质谱等结构分析仪器提供分子结构信息，可对化合物直接定性。气相色谱与这些仪器联用，将质谱等作为色谱的检测器，不仅可以定量测定，还可以利用质谱的定性特性对混合物成分进行定性。GC与MS的联用大大扩展了气相色谱的应用范围。

（2）定量分析

是根据检测响应信号大小，测定试样中各组分的相对含量，其依据是每个组分的含量与色谱检测器的峰高或峰面积响应值成正比。常用的气相色谱定量方法包括峰面积归一化法、外标法和内标法。

① 峰面积归一化法

如果待测样品各组分在色谱操作条件下都能出峰，而且已知其相对定量校正因子，则可以用归一化法测定各组分的含量。该法不需要称样和定量进样，操作简单方便，仪器及操作条件的轻微变动对结果的影响小，适用于多组分同时定量测定。但缺点也同样明显，样品中各组分都必须洗出且可测得其峰面积，不能有不产生信号或未洗出的组分，而且所有组分的定量校正因子都必须已知，这让归一化法的应用受到了一定的限制。

② 外标法

当气相色谱操作条件严格控制不变时，在一定进样量的范围内，物质的浓度与峰高呈线性关系，配制一系列不同浓度的已知样品，分别取同样体积的样品注射进气相色谱，根据所得色谱峰峰高或峰面积，做出标准曲线。分析未知样品时，注进与制作标准曲线同样体积的样品，按所测得的色谱峰峰高或峰面积，从标准曲线上查出未知样品浓度。外标法比较简单，常用于日常控制分析。定量结果的准确性主要取决于进样量的重复性和操作条件的稳定程度，为了获得较高的准确性，在日常工作中，定量校准曲线需要经常重复校正。

③ 内标法

内标法是选择一种样品中不存在的物质作为内标物，定量地加入到已知质量的样品中，通过测定内标物和样品中组分的峰面积，引入校正因子，就可计算样品中待测组分的含量。内标物一般要求是高纯化合物；与试样中各组分很好分离，且不与组分发生化学反应；分子结构、保留值和检测响应最好与待测组分相近。内标法可以获得较高的准确度，因为有内标进行校正，所以可以不需定量进样，可避免进样时体积变化带来的不确定因素，而且不需要所有的组分均被洗出。

2.气相色谱开发方法的验证

方法验证就是要证明所开发方法的实用性和可靠性。实用性一般指所有仪器配置是否全部可作为商品购得，样品处理方法是否简单易操作，分析时间是否合理，分析成本是否可被同行接受等。

1.方法的线性范围

即检测器响应值与样品量（浓度）成正比的线性范围，它主要由检测器的特性所决定。原则上，这一线性范围应覆盖样品组分浓度整个变化范围。线性范围的确定通常是采用一系列（多于3个）不同浓度的样品进行分析，以峰面积（或峰高）对浓度进行线性回归。当相关系数大于0.995时，就可以认为是线性的，小于0.995时，就超出了线性范围。一个好的气相色谱定量方法，其线性范围（以FID检测器为例）可达107，线性相关系数≥0.999。

2.方法的检测限

检测限（DL）是指方法可检测到的最小样品量（浓度）。一般的原则是按照3倍信噪比计算，即当样品组分的响应值等于基线噪声的3倍时，该样品的浓度被作为最小检测限，与此对应的该组分的进样量就叫作最小定量限。当用于法规分析时，这一数据应等于或低于法规方法所要求的实际样品中待测组分的最低允许浓度。

3.方法的回收率

方法回收率指方法测得的样品组分浓度与原来样品中实际浓度的比率。如果样品未经任何预处理，则回收率一般可不考虑。只有当某些样品组分被仪器系统不可逆吸附时，回收率才是需要考虑的问题。如果样品经过了预处理，如萃取工艺，那就必须考虑整个方法的回收率。一般要求回收率大于80%，越接近100%越好。

回收率可用下述简单方法测定：配置一定浓度的标准样品，将其两等分，其中一份按照方法步骤进行预处理，然后用GC分析；另一份则不经预处理而直接用GC分析。两份样品所得待测组分峰面积的比率乘以100%即是该组分的回收率。有时实际样品很复杂，特别是样品基质对预处理的回收率影响较大时，必须用空白样品基质（确定不含待测物）制备标准样品，比如测定废水中有机农药残留量时，就要采用不含农药的水作空白基质，在其中加人已知量的农药标准品，然后进行处理和分析。处理后所测得的组分含量与处理前加入量的比率乘以100%就得到了回收率。

回收率太低时会影响方法的检测限。当样品处理过程较复杂时，应分别测定回收率，最后针对回收率最低的步骤进行方法改进，以期提高整个方法的回收率。

4.方法的重复性和重现性

重现性是指同一方法在不同时间、地点、不同型号的仪器、不同操作人员使用时所得结果的一致性。与此近似的另一个术语是重复性，常指同一个人在同一台仪器上重复进样所得结果的一致性。事实上，文献中两者常常混用，多数人不作严格区分。对现代仪器来说，分析重复性是容易实现的，而重现性则是更重要的，也是方法验证所必须考察的。重现性和重复性都用多次分析所得结果的相对标准偏差（RSD）来表示。

方法的重现性应包括多次连续进样分析的重复性、不同时间（天与天之间）分析的重复性、不同型号仪器之间的重现性和不同实验室之间的重现性。首先应测定重复性，即在相同条件下连续进样5-10次，统计待测组分的保留时间和峰面积（或峰高）的相对标准偏差，一般要求保留时间的相对标准偏差不大于1%，峰面积的相对标准偏差不大于5%。

如果样品要预处理，还应测定同一样品多次处理的重复性，即同一样品取3-5份做平行处理，看最后测定结果的重复性。这一相对标准偏差值应不大于5%。

当上述重复性满足要求后，说明该方法在这个实验室是可靠的。要将此方法作为标准方法推广使用，还必须测定不同仪器、不同实验室之间的重现性。当这些重现性的相对标准偏差都能满足要求时，这一方法的可靠性就得到了较满意的验证。

根据以上步骤，我们就可以系统地建立和优化气相色谱分析方法，从而确保分析结果的准确性和可靠性。希望这个开发方法对你有所帮助！

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