质粒载体是分子生物学研究中使用十分普遍的工具之一，含有我们目的片段的质粒常常通过转染细胞用于体外探究外源基因的生物学功能。通过对基因进行修饰例如点突变、过表达、敲低、敲除等手段获得不同质粒，这为一些分子生物学实验例如功能增益缺失实验、双荧光素酶报告基因实验都提供了便利的基础。

质粒构建，我们首先需要获取我们需要构建在原生质粒载体上的目的片段，如过表达载体一般会构建目的基因的cds区，双荧光素酶报告基因载体一般是构建包含结合位点的目的片段，其次我们可以根据选定的目的片段通过Snapgene软件进行引物设计。获取目的的片段后，我们需要对获取的目的片段和选取的质粒载体进行双酶切暴露出粘性末端；然后用T4连接酶进行酶连。连接产物通过感受态细胞（DH5α）转化，最后进一步对单克隆菌落进行鉴定。

在这里主要介绍传统双酶切的质粒构建方法：

1、目的片段的获取：基因组DNA、cDNA

注意：上述过程中前三个步骤均可以通过琼脂糖凝胶电泳通过DNA marker初步确认所获取的片段并进行琼脂糖凝胶纯化回收（试剂盒），测定浓度。

过表达载体质粒构建的步骤：以人p65基因为例，质粒载体为PcDNA3.1(+)

（1）目的片段的获取、扩增

①通过NCBI网站获取p65基因的cds区：1647bp

图1

图2

②点击CDS:

图3 CDS区

③复制标红区域进入Snapgene软件，新建DNA文件：

图4

④点击序列（sequence）：然后编辑——插入——限制性酶切位点（选择NotI、XhoI）

图5

⑤其次对目的片段进行引物设计：设计原则：正向引物 （F）：选择的限制性内切酶的常用保护碱基+酶切位点+目的片段前18-22bp；反向引物（R）：选择的限制性内切酶的常用保护碱基+酶切位点+目的片段后 18-22bp的反向互补序列。

Forward：

图6

Reserve:

图7

⑥此时我们打开snapgene软件的引物框，对引物进行优化；优化原则包括Tm值、GC含量、引物长度等。

图8

图9

（2）获取引物后对cDNA进行PCR扩增获得我们需要的目的片段（表 1），并通过琼脂凝胶电泳鉴定：snapgene模拟琼脂糖凝胶电泳（图10）。

表1 PCR扩增体系

图10

2、酶切质粒载体和目的片段 

选择NotI、XhoI双酶切质粒载体PcDNA3.1(+)和目的片段，并用琼脂糖凝胶电泳鉴定 。

表2 酶切体系

图11 PcDNA3.1(+)质粒

3、酶连

通过T4连接酶过夜连接。

注意：酶切质粒与酶切目的片段的比值一般为1:3或者1:4。

4、使用DH5α大肠杆菌感受态细胞转化

①取4ul或者5ul连接产物，加入到50ul或者100ulDH5α大肠杆菌感受态细胞中，轻轻混匀，静置冰浴30min；②打开水浴锅至42℃，热激45s；③冰浴2min;⑤于超净工作台加入适量LB液体培养基，混匀；⑥37℃，200rpm摇床约1h；⑦涂含相应抗生素的LB平板。

5、最终对平板的单克隆菌落进行筛选鉴定（菌落PCR/DNA测序）

表3 菌落PCR的体系

对第二天长出来的单克隆菌落进行初步菌落PCR；根据表3的PCR扩增体系基本步骤如下：①对选取的单克隆菌落做好标记（序号、日期），以便于后续摇菌提取质粒；②加入10ul无核酶水透明的八联管或者200ul的PCR管（标记相对应的序号），用10ul的移液枪用tip头沾取菌落于PCR管中吹打；③用封口膜封好LB平板；在实验台上按照表3的体系进行PCR扩增；④最后用琼脂糖凝胶电泳验证DNA条带有无或者位置是否正确 。

6、验证实验

后续若进行功能性验证实验还需要进行细胞转染检测转染效率并通过RT-qPCR、蛋白免疫印记技术对目的基因的表达进行检测。

7、注意事项

提及一下双荧光素酶报告基因载体的构建，常用的质粒载体有pmirGLO Vector(7350bp)、Psicheck-2（ 6273bp），通常应用于启动子相关的、miRNA-mRNA、lncRNA-miRNA的靶向验证关系。以miRNA-mRNA为例，通过TargetScan 在线靶基因预测网站对所研究miRNA的靶基因进行预测结合位点，寻找靶基因于miRNA的结合序列前后200-300构建值双荧光素酶报告基因载体中，并突变掉结合位点的几个碱基，同样构建200-300bp左右至双荧光素酶报告基因载体中。最后结合双荧光素酶报告基因的原理进行靶向验证。