摘 要： 建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速检测蜂蜜中10种氨基甲酸酯类农药残留。采用乙腈提取，中性氧化铝固相萃取柱净化，采用Alphasil VC-C18柱分离，以2 mmol/L甲酸铵-0.01 %甲酸水溶液-甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，流量为0.2 mL/min，多反应监测模式检测。10种目标物的质量浓度在5.0～100 μg/L的范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99，检出限为0.78～1.0 μg/kg。样品加标平均回收率为64.71～103.10 %，测定结果的相对标准偏差为2.08%～5.62 %（n=6）。该方法简便、快速，灵敏度、准确度高，能够满足蜂蜜中10种氨基甲酸酯类多农残的高通量检测分析要求。

关键词： 超高效液相色谱-质谱法； 氨基甲酸酯类； 农药残留； 蜂蜜

 

蜂蜜不仅具有较好的保健功能，还有较高的营养价值，是人们喜爱的蜜蜂产物。与其他农副食品产业情况不同，蜂蜜因其生产特殊性，产品容易受到农药残留影响。当大量施播农药时，自然界中可能存在农药残留，蜜蜂在采蜜过程中会接触到这些残留农药。一部分蜜蜂死亡，一部分蜜蜂将残留带到蜂巢中，不仅提高了蜜蜂的抗药性，还可能影响、污染蜂巢环境，包括蜂王的产卵行为、工蜂分工行为、蜜蜂采蜜行为、同群和外群工蜂识别功能及蜂群的学习行为，最终可能对蜂蜜的质量和食用者的健康产生负面影响。

自20世纪70年代以来，随着有机氯农药的禁用或限用，抗有机磷农药的昆虫品种日益增多。2007年，5种高毒有机磷农药的禁用进一步推动了氨基甲酸酯类农药的开发，这类农药旨在弥补有机氯和有机磷农药的缺陷，成为一种新型的广谱杀虫剂、杀螨剂和除草剂。然而，某些氨基甲酸酯类农药的毒性极大，例如涕灭威和克百威已被国家列为禁用农药，速灭威和残杀威等则被报道对蜜蜂具有高毒性。因此，氨基甲酸酯类农药的不科学使用常导致人畜中毒事件的发生[1]。目前该类农药残留检测主要集中在植物源性食品及环境检测的水、土壤中[2-3]，对于动物源性食品中氨基甲酸酯类农药多残留的高通量分析方法与文献报道却十分少见[4-5]，不能完全监控易受农残影响的蜂蜜中氨基甲酸酯类农残质量安全，势必会造成蜂产品质量安全监管的缺失。

有关氨基甲酸酯类农残检测方法报道很多，常用的包括气相色谱(GC)法[6]、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法[7-9]、高效液相色谱(HPLC)法[10-12]、高效液相色谱-质谱联用(HPLC/MS)法[13-15]、超临界色谱(SFC)法和薄层色谱(TLC)法[16]等。然而因为样品复杂基质的影响，HPLC、GC方法很难将农残多组分完全分离，且衍生过程较为繁琐，检测限相对较高；TLC法对生物高分子分离效果不甚理想；SFC法流体自身稳定性不佳，使用条件苛刻，重现性不佳，成本又较为高昂；GC-MS法因氨基甲酸酯类农药在高温下本身不稳定的特性而直接被限制；HPLC/MS法具有灵敏度高、检出限低、抗干扰能力强、分析速度快等特点，近年已逐步成为氨基甲酸酯类农药检测的首选方法[17-19]。

笔者通过优化仪器条件和样品前处理过程，建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速检测蜂蜜中氨基甲酸酯类农药残留，该方法简便、高效，灵敏度、准确度高，可用于蜂蜜中10种氨基甲酸酯类多农残的高通量检测分析。

 

1. 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱-串联质谱仪：LCMS-8050型，日本岛津仪器有限公司。

多样品涡旋混合器：MultiVortex型，广州得泰仪器科技有限公司。

旋转蒸发仪：HB 10 S96型，德国艾卡集团有限公司。

高速冷冻离心机：GL-20G-Ⅱ型，上海安亭科学仪器有限公司。

电子天平：ATY224型，感量为0.1 mg，日本岛津仪器有限公司。

超纯水系统：Milli-Q DirectB型，德国默克密理博有限公司。

LC-C18固相萃取柱：500 mg（6 mL），上海安谱实验科技股份有限公司。

NH2固相萃取柱：500 mg（6 mL），上海安谱实验科技股份有限公司。

中性氧化铝固相萃取柱：1 000 mg（3 mL），深圳逗点生物技术有限公司。

乙腈、二氯甲烷、甲醇：均为色谱纯，美国霍尼韦尔国际公司。

甲酸：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

甲酸铵、氯化钠：均为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

农药混合标准品溶液：含灭多威、克百威、3-羟基克百威、涕灭威、涕灭威砜、涕灭威亚砜、速灭威、甲萘威、异丙威、仲丁威，各组分质量浓度均为100 μg/mL，批号为23050036，坛墨质检标准物质中心。

蜂蜜样品：陕西产地，散装农家土蜂蜜。

实验用水为超纯水系统制备实验室用一级水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 液相色谱仪

色谱柱：Alphasil VC-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.5 μm，华谱科仪大连科技有限公司）；柱温：35 ℃；进样体积：5 μL；流动相：A相为2 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸水溶液，B相为甲醇溶液，流量为0.2 mL/min；；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Program of gradient elution

 

注：A相为2 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸水溶液，B相为甲醇溶液。

 

1.2.2 质谱仪

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测模式(MRM)；接口电压：3.0 kV；接口温度：300 ℃；脱溶剂管温度：250 ℃；加热模块温度：400 ℃；加热气流量：10 L/min；干燥气流量：10 L/min；雾化气流量：3 L/min，10种农药残留的质谱参数表2。

表2   10种农药残留的质谱参数

Tab. 2   Mass spectrum parameters of 10 pesticide residues

注：带*的为定量离子。

 

1.3 实验步骤

1.3.1 样品预处理

称取2 g蜂蜜样品(精确到0.001 g)于50 mL离心管中，加入10 mL水涡旋混匀1 min，静置5 min，再加入15 mL乙腈涡旋混匀1 min，以10 000 r/min离心5 min，转移上层溶液到另一个50 mL离心管中。残渣再次加入15 mL乙腈，重复提取一次，合并两次提取上清液，在合并液中加入过量NaCl涡旋混匀1 min，再以10 000 r/min离心5 min，转移上层乙腈相到浓缩瓶中，旋转蒸发至近干，残渣用2 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5，体积比，下同)溶液溶解，待净化。

用6 mL二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液活化中性氧化铝SPE小柱，将上述待净化液全部转移上柱，收集流出液，再用二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液4 mL分2次洗瓶后过柱，最后用二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液2 mL洗脱，收集全部流出液，40 ℃氮吹至近干，用1 mL的体积分数为60%乙腈复溶，过0.22 μm滤膜作为样品溶液。

1.3.2 溶液的配制

10种氨基甲酸酯类农药混合标准中间液：吸取1.0 mL农药混合标准品溶液，用甲醇稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成1.0 μg/mL的农药混合标准中间液，于-20 ℃避光保存。

10种氨基甲酸酯类农药系列混合标准工作溶液：准确吸取适量10种农药混合标准中间液，用体积分数为60%的乙腈稀释配制成质量浓度均分别为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L的系列混合标准工作溶液，临配现用。

1.3.3 样品测定

将配制好的系列混合标准工作溶液和样品溶液装入1 mL液相色谱专用样品瓶中，在1.2仪器工作条件下上机测定，以外标法定量。

 

2. 结果与讨论

 

2.1 流动相的选择

依据目标物特性选用了三种不同流动相，分别为甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水、甲醇-2 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸水溶液，通过考察流动相对色谱分离和灵敏度的影响，进而选择最优流动相。试验发现，当采用乙腈作为有机相时，灭多威、涕灭威砜、涕灭威亚砜等峰形变差，大多数农药响应明显不如甲醇做有机相。同时，在水相中添加甲酸和甲酸铵后，各化合物的离子化效率提高，灵敏度更好[20]，因此最终采用甲醇-2 mmol/L甲酸铵-0.01%甲酸水溶液作为流动相。通过再优化流动相梯度洗脱程序，10种氨基甲酸酯类农药也得到了最佳分离，加标样品总离子流色谱图如图1所示。

图1   加标样品总离子流色谱图

Fig. 1   Total ion flow chromatogram of the labeled sample

1—克百威；2—仲丁威；3—灭多威；4—涕灭威；5—涕灭威砜；6—涕灭威亚砜；7—异丙威；8—速灭威；9—甲萘威；10—3-羟基克百威

 

2.2 固相萃取柱的选择

蜂蜜样品中含有大量糖类等内源性杂质，经过初步分离萃取之后，仍然有其他杂质可能被乙腈一并提取出来，干扰了目标组分，降低了检测灵敏度，所以需要使用固相萃取(SPE)小柱对目标组分进行净化。考察了C18柱、NH2柱、中性氧化铝柱的分离净化效果，结果表明，使用C18柱时杂质未能有效去除，灭多威、涕灭威、涕灭威亚砜等目标组分回收率极低；NH2柱的净化效果稍好，但仍不理想；中性氧化铝柱净化效果最好，其中灭多威、涕灭威砜等回收率明显优于NH2柱净化效果，这是由于灭多威等极性较强，在NH2柱上有更大保留作用，不容易被洗脱下来，10种氨基甲酸酯类农药的回收效果也都较好，因此最终选用中性氧化铝柱作为氨基甲酸酯类农药的净化SPE小柱。

2.3 洗脱液体积的优化

将一定量加标样品过中性氧化铝柱，选用不同体积(0、2、5、8、12、15 mL)的二氯甲烷-甲醇(95∶5)溶液洗脱，合并收集洗脱液，氮吹至近干，再用60%乙腈复溶后进行色谱质谱分析。结果表明，洗脱液体积为2 mL时各目标物回收率均明显高于其他洗脱液梯度回收率，这是因为灭多威等目标物极性较强，在SPE小柱上有较大保留作用，不易被洗脱下来，当洗脱液体积为2 mL时，目标物回收率最高；再增加洗脱液体积后所有目标农药回收率快速下降，这可能由于洗脱液体积增大，进一步氮吹挥干时间增长，目标农药不稳定导致待测物质损失，因此选择洗脱液体积为2 mL。

2.4 线性方程及检出限

取系列混合标准工作溶液，在1.2仪器工作条件下进样分析，以目标组分峰面积(y)为纵坐标，以待测液农药浓度(x)为横坐标，绘制标准工作曲线，采用最低质量浓度标准工作溶液进样分析，并计算信噪比，其中信噪比大于等于3为检出限，信噪比大于等于10为定量限。10种氨基甲酸酯类农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限见表3。由表3可知，10种目标物的质量浓度在线性范围为5.0～100 μg/L的范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均大于0.99，方法检出限为0.78～1.0 μg/kg，表明该方法有较好的灵敏度。

表3   10种氨基甲酸酯类农药的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

Tab. 3   Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit of 10 kinds of carbamate pesticides

 

2.5 加标回收与精密度试验

对空白样品进行3个不同浓度水平(2.5、10.0、50.0 μg/kg)的加标回收试验，每个浓度水平平行测定6次，在1.2仪器工作条件下进样测定。加标回收与精密度试验结果见表4，由表4可知，10种农药的平均回收率为64.71%~103.10%，测定结果的相对标准偏差（RSD）为2.08%～5.62%(n=6)，依据GB/T 27404—2008《实验室质量控制规范食品理化检测》附录F检测方法分析技术要求，结果满足多种农残分析要求和实际检测需要。

表4   加标回收与精密度试验结果

Tab. 4   Results of standard recoveries and precision test

注：低、中、高3个加标水平浓度分别为2.5、10.0、50.0 μg/kg。

 

2.6 基质效应评价

基质效应(ME)评价主要是通过测定相同浓度梯度的空白基质标液与纯溶剂标液中离子信号强度，比较基质标曲与纯溶剂标曲的斜率进而评价效应的大小。基质效应按式(1)计算：

 

ME/%=(-1)×100 (1)

当斜率比小于1，表示存在基质抑制；斜率比大于1，表示存在基质增强。其中斜率比在0.8～1.2之间(即|ME|在20%以内)时，通常认为是弱基质效应；斜率比在0.5～0.8或1.2～1.5之间(|ME|在20%～50%之间)时，可以认为是中等基质效应；而斜率比小于0.5或大于1.5时(|ME|超过50%)，则被认为是强基质效应。按1.3实验步骤比较了浓度为5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg/L时的基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率，结果表明，10种氨基甲酸酯类农药的|ME|值均在20%之内，说明其基质效应存在但影响较弱，因此选用溶剂标准曲线进行定量校正。

 

3. 结语

 

建立了超高效液相色谱-串联质谱法快速检测蜂蜜中10种氨基甲酸酯类农药残留，该方法简便、快速，且精密度和准确度均可满足试验要求。同时首次创新尝试进行市售蜂蜜产品中多种氨基甲酸酯类农残的风险监测，也为蜂蜜及蜂产品的质量安全日常监管提供了有力的技术支持。

 

 

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引用本文： 杨琦，房忠芳，孟虎，等 . 超高效液相色谱-串联质谱法快速检测蜂蜜中10种氨基甲酸酯类农药残留［J］. 化学分析计量，2024，33（11）：85. (YANG Qi, FANG Zhongfang, MENG Hu, et al. Rapid determination of 10 carbamate pesticide residues in honey by ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 85.)