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嘉峪检测网 2019-08-30 08:34
器审中心于2019年8月27日，发布美国赛沛公司的《甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸 联合检测试剂盒（实时荧光 PCR 法）》技术审评报告。从这份报告中，我们可以了解甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸 联合检测试剂盒（实时荧光 PCR 法）在研发阶段需要做哪些检测实验。
医疗器械产品注册技术审评报告
基本信息
产 品 中 文 名 称 ：甲型/乙型流感及呼吸道合胞病毒核酸 联合检测试剂盒（实时荧光 PCR 法）
产品英文（原文）名称：Xpert Xpress Flu/RSV Assay
产 品 管 理 类 别 ：三类
申请人名称 ：美国赛沛公司 Cepheid
临床前研究摘要：
（一）主要原材料
本产品的主要原材料包括：引物和探针、DNA Taq 酶、逆转 录酶和 dNTPs。引物和探针由申请人设计并生产，其他主要原材 料均购自外部供应商。各主要原材料均通过质量标准并检验合 格。
试剂盒在企业内部产品放行之前使用企业参考品进行最终 放行检测。阴性参考品中含有其他病原体，对试剂盒的特异性
进行质控；阳性参考品中含有甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒，使用时稀释至指定浓度后再进行确认检测， 试剂盒检测结果符合质控标准后才可放行使用。
试剂盒包含样本处理质控（SPC）作为内部质控。SPC 用于 验证流感病毒和 RSV 是否能正确释放 RNA，从而确保样本处理 过程的正确性，同时可以监测 RT-PCR 和 PCR 反应中与样本相 关抑制作用。
（二）生产工艺及反应体系研究
申请人通过对试剂主要生产工艺的研究，确定了最佳生产 工艺。
申请人对反应体系中的引物和探针浓度、DNA Taq 酶、逆转 录酶、离子和 dNTPs、加样体积以及 PCR 反应体系条件等进行筛 选和优化，并通过验证最终确定了最佳反应体系。
（三）分析性能评估
本产品分析性能评估内容主要包括：最低检出限、分析特 异性、分析反应性、干扰物质、携带污染、重复性等。
在最低检测限研究中，申报产品对两种甲型 H3N2 流感毒株、 两种甲型 2009 H1N1 流感毒株、两种乙型流感毒株、两种呼吸 道合胞病毒 A（RSV A）毒株和两种呼吸道合胞病毒 B（RSV B） 毒株进行检测并得到各毒株的 LoD 值如下：
|
病毒株 |
LoD（TCID50/mL） |
|
Influenza A/California/7/2009 |
0.02 |
|
Influenza A/Florida/27/2011 |
0.04 |
|
Influenza A/Perth/16/2009 |
0.01 |
|
Influenza A/Victoria/361/2011 |
0.75 |
|
Influenza B/Mass/2/2012 |
0.40 |
|
Influenza B/Wisconsin/01/2011 |
0.19 |
|
RSV A/2/Australia/61 |
0.87 |
|
RSV A/Long/MD/56 |
1.10 |
|
RSV B/Wash/18537/62 |
0.79 |
|
RSV B/9320/MA/77 |
2.30 |
在分析特异性研究中，检测 44 种代表常见呼吸道病原体或鼻咽中可能存在的病原体培养基来评价 Xpert Xpress Flu/RSV Assay 的分析特异性，分析特异性为 100%。各菌株及其浓度见 下表：
|
微生物 |
浓度 |
|
腺病毒 1 型 |
1.12E+06 TCID50/mL |
|
腺病毒 7 型 |
1.87E+05 TCID50/mL |
|
人冠状病毒 OC43 |
2.85E+05 TCID50/mL |
|
人冠状病毒 229E |
1.00E+05 TCID50/mL |
|
巨细胞病毒 |
1.00E+05 TCID50/mL |
|
埃可病毒 |
3.31E+07 TCID50/mL |
|
肠病毒 |
3.55E+05 TCID50/mL |
|
EB 病毒 |
7.16E+07 TCID50/mL |
|
单纯疱疹病毒 |
8.90E+05 TCID50/mL |
|
麻疹病毒 |
6.31E+05 TCID50/mL |
|
人类偏肺病毒 |
1.00E+05 TCID50/mL |
|
流行性腮腺炎病毒 |
6.31E+06 TCID50/mL |
|
人副流感病毒 1 型 |
1.15E+06 TCID50/mL |
|
人副流感病毒 2 型 |
6.31E+05 TCID50/mL |
|
人副流感病毒 3 型 |
3.55E+06 TCID50/mL |
|
鼻病毒 1A 型 |
1.26E+05 TCID50/mL |
|
鲍氏不动杆菌 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
洋葱伯克霍尔德菌 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
白色念珠菌 |
3.20E+06 CFU/mL |
|
近平滑念珠菌 |
3.00E+06 CFU/mL |
|
百日咳杆菌 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
肺炎衣原体 |
1.00E+05 CFU/mL |
|
弗氏柠檬酸杆菌 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
棒状杆菌属 |
3.30E+06 CFU/mL |
|
大肠埃希菌 |
1.00E+07 CFU/mL |
|
粪肠球菌 |
1.30E+06 CFU/mL |
|
流感嗜血杆菌 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
罗伊氏乳杆菌 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
军团菌属 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
卡他莫拉菌 |
1.00E+07 CFU/mL |
|
结核分枝杆菌（无毒性） |
1.00E+06 CFU/mL |
|
肺炎支原体 |
1.00E+06 CFU/mL |
|
脑膜炎奈瑟球菌 |
2.15E+06 CFU/mL |
|
粘液奈瑟球菌 |
1.00E+07 CFU/mL |
|
痤疮丙酸杆菌 |
2.40E+07 CFU/mL |
|
铜绿假单胞菌 |
3.70E+06 |
CFU/mL |
|
金黄色葡萄球菌 （产蛋白 A） |
2.20E+06 |
CFU/mL |
|
表皮葡萄球菌 |
3.40E+06 |
CFU/mL |
|
溶血葡萄球菌 |
4.00E+06 |
CFU/mL |
|
无乳链球菌 |
3.50E+06 |
CFU/mL |
|
肺炎链球菌 |
1.00E+06 |
CFU/mL |
|
酿脓链球菌 |
1.00E+07 |
CFU/mL |
|
唾液链球菌 |
1.00E+07 |
CFU/mL |
|
血链球菌 |
3.10E+06 |
CFU/mL |
在干扰物质研究中，对鼻咽中潜在的干扰物质进行了研究， 主要有血液、鼻腔分泌物或粘液、鼻和咽喉中用于缓解鼻塞、 鼻腔干燥、刺激或哮喘和过敏症状的药物，以及抗生素和抗病 毒药物等，其浓度详见下表。
|
物质／分类 |
检测浓度 |
|
β肾上腺素支气管扩张剂 |
0.83 mg/mL（即 1 剂／天） |
|
血液 |
2% (v/v) |
|
BD™Universal Viral Transport System |
100% (v/v) |
|
Remel M4® |
100% (v/v) |
|
Remel M4RT® |
100% (v/v) |
|
Remel M5® |
100% (v/v) |
|
Remel M6® |
100% (v/v) |
|
咽喉含片、口服麻醉药和镇痛 药 |
1.7 mg/mL |
|
粘蛋白 |
2.5% (w/v) |
|
抗生素，鼻用软膏 |
10 mg/mL |
|
生理盐水鼻喷雾剂 |
15% (v/v) |
|
Anefrin 鼻喷雾剂 |
15% (v/v) |
|
PHNY 滴鼻剂 |
15% (v/v) |
|
达菲，抗病毒药 |
7.5 mg/mL |
|
抗菌药，全身性 |
4µg/mL |
|
Zicam 鼻用凝胶 |
15% (w/v) |
|
鼻用皮质类固醇 |
5µg/mL |
在本研究的检测浓度下，所有物质均未对检测试剂盒检测结果造成干扰。
在携带污染研究中，使用相同的 GeneXpert 模块检测阴性 样本后立即检测加有极高水平甲型流感样本或极高水平 RSV A 样本的模拟基质。该研究显示一次性使用、单独包装的检测盒 可避免在同一模块检测阴性样本后对极高水平阳性样本的携带 污染。
在重复性实验中，申请人采用三批成品试剂盒，通过对阴性样本、Flu A 低水平阳性、Flu A 中等水平阳性、Flu B 低水 平阳性、Flu B 中等水平阳性、RSV 低水平阳性和 RSV 中等阳性 样本的检测，评估了试剂盒的重复性。同时，一项多中心的研 究检测了包括一份阴性质控品和浓度为其 LoD 1 倍（低水平阳 性）和 2-3 倍（中等水平阳性）的甲型流感、乙型流感或 RSV 的模拟基质各两份，评估了批内/批间、日内/日间、研究中心 间以及不同操作者之间的精密度。结果显示试剂盒在仪器间、 批内/批间、日内/日间、研究中心间无统计学显着差异。
（四）阳性判断值或参考区间研究
申请人通过临床前研究确定阳性判断值，并经临床研究采 用临床样本验证阳性判断值。临床前数据来源于一项临床前研 究，使用该试剂盒与对比方法进行比对试验，分别检测一定例 数的样本，通过研究二者的阳性符合率（PPA）和阴性符合率（NPA），以及真阳性结果的分布和频率等最终得出，试剂盒对 于 Flu A（Flu A 1 和 Flu A 2）、Flu B 和 RSV 的阳性判断值 为 Ct=40。
临床研究共收集了 2580 份受试者样本，其中 2167 份纳入 最终统计。相对于参考试剂盒, 本试剂盒检测 Flu A 的 PPA、NPA 和总体百分比一致性（OPA）分别为 98.2%、98.0%和 98.0%。试剂盒检测 Flu B 的 PPA、NPA 和 OPA 分别为 100%、98.5%和98.6 %。试剂盒检测 RSV 的 PPA、NPA 和 OPA 分别为 99.0%、98.6%和 98.7%。综合以上研究确认，本产品的阳性判断标准为 Ct 值小于或等于 40 时为阳性，Ct 大于 40 时为阴性。
（五）稳定性研究
申请人对本产品的稳定性进行了研究，确定了在各种条件 下本产品的有效保存时间。在 2℃、28℃、35℃、45℃和 50℃ 下随时间监测三批试剂盒的性能。在不同时间点分别使用试剂 盒检测阴性、低水平阳性和高水平阳性样本，每批收集了 19 个 月的阳性和阴性样本实时数据。结果显示在 2～28℃下，试剂盒 有效期为 18 个月。
样本稳定性研究：将阴性和阳性样本储存于不同温度下， 在不同的时间点进行检测，研究表明鼻咽拭子样本在使用试剂 盒进行检测前，可储存于室温（15～30℃）下达 24 小时和冷藏
（2～8℃）温度下储存达 7 天。
来源：国家药品监督管理局
