摘 要
药物制剂经非口服途径给药，对给药局部产生的毒性、刺激性和/或对全身产生过敏性和溶血性等均属于制剂安全性的范畴，是药物非临床安全性评价的重要组成部分。药物制剂安全性评价中经常出现不规范或不符合指导原则等科学规范问题，无法为临床试验和用药提供足够的非临床安全性信息。本文结合审评工作中发现的相关问题进行讨论，以期为申请人及安评机构在开展药物制剂安全性评价时提供借鉴。
药物制剂安全性试验又称特殊安全性试验或局部安全性试验，包括刺激性、过敏性及溶血性等试验，评价药物在经非口服给药途径下对用药局部产生的毒性和/或对全身产生的毒性，如眼、耳、鼻、舌下、呼吸道、关节腔、皮肤、直肠、阴道、血管、肌肉、皮下和髓鞘等。药物毒性来源主要包括药物活性成分及其代谢物、辅料、杂质及pH值、渗透压等制剂理化性质，这些因素可引起刺激性和/或过敏性和/或溶血性的发生，因此药物在临床应用前应研究制剂在给药部位使用后引起的局部和/或全身毒性，以提示临床应用时可能出现的毒性反应、毒性靶器官和安全范围。
目前，药物制剂安全性的研究指南主要为《药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》（2014年），根据国外药物研究评价的经验积累，参考了国外相关技术指南，如美国国家食品药品监督管理局针对仿制透皮制剂产品皮肤刺激性及致敏性研究指南、光安全测试指南、新药免疫毒理学评价指南、欧洲药品管理局药品非临床局部测试指南，此外还参考了国际标准化组织关于医疗器械生物学评价中关于刺激性和迟发过敏性反应试验的相关研究策略。同时，需要指出的是，该指导原则收载了试验方法的一般原则，具体评价中应根据受试物的特点进行合理设计。制剂安全性试验的评价工作或审评过程，既有强制性要求，如药物非临床研究质量管理规范（GLP）的遵从性，也需要对一般试验设计基本原则的遵循，如试验设计与实施应当遵从试验研究的“随机、对照、可重复”原则，根据受试物的特点，充分考虑和结合药学、药效学、其他毒理学及临床拟定用法用量等进行综合评价，体现整体性、综合性的原则。本文结合审评工作中发现的相关问题进行讨论，以期为申请人及安评机构在开展药物制剂安全性评价时提供借鉴。
1、 制剂安全性研究开展的必要性
非口服给药途径的药物一般均需获得足够的非临床制剂安全性信息。目前，仍有申请人忽视产品制剂安全性研究的重要性，审评中遇到未按照相关要求开展制剂安全性研究，或者未按指导原则的要求完成规范的制剂安全性研究，无法为后续的临床试验或上市提供充分的制剂安全性风险提示，导致临床试验申请或上市申请进度受影响。常忽视开展制剂安全性试验的药物剂型包括阴道栓剂、直肠栓剂、舌下透皮吸收制剂、皮肤外用制剂等。应当根据拟开发药物制剂的自身特点考虑开展相关研究的必要性。
【案例1】 盐酸多塞平口颊膜按化药注册分类“2.2”申报，系在美国批准的低剂量盐酸多塞平片基础上的改良型药物，将片剂改为口颊膜，申请适应证相同，为用于治疗睡眠维持困难的失眠症。申请人未开展制剂安全性研究，而口颊膜作为一种经口腔给药和吸收的制剂，具有潜在的口腔黏膜刺激性风险，应进行口腔黏膜刺激性试验，为临床试验提示相关风险。
【案例2】 他达拉非口溶膜按化药注册分类“2.2”申报，口溶膜制剂学特性类似于口腔崩解片，不同于口含片、舌下含片，口腔局部存留时间较短，口腔黏膜几乎不吸收，类似于口服制剂经胃肠道吸收，故审评考虑可不要求提供该制剂口腔黏膜给药的制剂安全性研究数据。
2、GLP遵从性
《中华人民共和国药品管理法》（2019年版）规定“药物的非临床安全性评价研究机构必须执行药物非临床研究质量管理规范”。最新修订的《药品注册管理办法》（2020年版）也明确规定：药物非临床安全性评价研究应当在经过药物非临床研究质量管理规范认证的机构开展，并遵守GLP。药物非临床制剂安全性作为非临床安全性的一部分，应当执行GLP规范。目前，仍有少数制剂安全性试验在非GLP条件下开展，不符合相关法律法规要求，也不利于试验质量的保障。
3、制剂安全性评价关注点
3.1 供试品分析
供试品分析揭示受试品的质量和配制的准确性，为临床前安全评价中发现的问题（如毒性与剂量关系等）提供可靠的科学参考。如果供试品存在问题，安评的结果可能失去了技术评价的价值，甚至可能误导新药的后期开发。因此，供试品检测对于新药安全性评价具有重要意义，应该在安全性评价试验中进行科学的供试品检测。例如，注射剂浓溶液或注射用粉针剂在使用前，应当根据临床拟用的真实情况进行配制，配制后需要开展供试品分析，以便在非临床试验中正确使用。若临床拟用样品为制剂原液，往往企业会向安评机构提供其质量检验合格报告，表明相关供试品的检测信息，不需要在安评机构重新开展供试品分析。一般来说，应根据供试品的特性及具体毒理试验的要求在试验方案中确定误差范围，化学药物配制后的溶液及混悬浓度与理论可接受误差范围为：溶液为±10%，混悬液为±15%。生物技术药物供试品分析的方法选择和技术要求一般应遵从Case by case的原则开展，如根据生物活性分析等方法进行含量检测。
除了供试品分析之外，用于非临床安全性评价试验的供试品质量信息提供方面也存在一些影响安全性评估的问题，如供试品的重要信息缺失，供试品浓度和含量分析的方法学验证资料和配制后供试品质量检测结果等。另外，试验样品制备工艺不成熟，可能导致不同批次的样品质量（含量、纯度、杂质、晶型等）不一致，进而影响安全性评价试验数据的准确、可靠。更有甚者，试验单位未开展或未提供供试品分析报告，或者供试品分析报告显示“不合格”，仍采用该试剂开展制剂安全性研究。
【案例3】 某氨茶碱注射液申报仿制药一致性评价，用色谱法对配制的供试品及原研制剂低浓度制剂（质量浓度6.25 mg·mL-1）进行分析，无水茶碱测定浓度为理论浓度的77.87%~81.36%，供试品配制可能存在较大误差，不符合供试品分析的相关要求（±10%）。
3.2 试验动物种属选择
动物种属的选择应当根据解剖学、生理学、代谢反应、遗传学和免疫反应来选择特定研究需要的最合适的模型，同时应当考虑观察指标和模型合理性确定，如皮肤刺激性试验应选择与人类皮肤结构比较相近的动物，如兔、小型猪等。在涉及皮肤给药途径的药物制剂安全性研究中，小型猪可能比任何其他动物模型更接近地模拟人类反应，主要原因是其与人类在皮肤解剖学、生理学和生物化学方面具有相似性，具有大量人类共有的膜转运和酶蛋白质，使得小型猪是理想的皮肤外用途径生物医学研究与开发中的转化模型。
3.3 制剂安全性研究的常见问题
制剂安全性研究的内容一般包括刺激性、过敏性及溶血性试验，应当根据药物临床拟用情况合理设计试验中的给药剂量、给药浓度及给药体积等关键性指标。例如，临床使用中涉及不同药物浓度的情况时，应当采用临床拟用最高浓度开展刺激性研究；多品规同时申报，应当考虑不同规格之间浓度一致性、是否仅为装量的差异、辅料是否等比例等因素，针对多浓度规格品种应当至少采用临床使用最大浓度开展制剂安全性评价；对于一致性评价品种，还应当选择相同品规的参比制剂平行开展对照研究，且参比制剂应当被国家局公布的《参比制剂目录》收录。现以案例的形式，对申报资料中常见的具体试验问题进行梳理。
3.3.1 试验动物数量不足
在试验设计时，动物数量的确定需要考虑实验动物伦理“3R”原则（replacement，reduction，refinement），同时也需要满足统计学要求。
【案例4】 某葡萄糖酸钙注射液的仿制品种，用兔开展静脉注射刺激性试验，试验选用健康日本大耳白兔4只（2雌2雄），用同体左右侧自身对照法，每只动物右侧耳缘静脉给予供试品，左侧耳缘静脉给予同体积5%葡萄糖注射液，连续给药，试验设置给药期末及恢复期末剖检时间点（各1雌1雄）。本试验设置动物数量偏少，无法满足统计学要求，在后续的观察中可能存在对阳性结果分析的难度。此类试验，一般应当考虑到给药期末及恢复期末的2个解剖观察时间点，应保证每个剖检时间点的动物数据至少支持统计学计算。
3.3.2 刺激性试验问题
刺激性是指非口服给药制剂给药后对给药部位产生的可逆性炎症反应，一般应选择与临床给药相似的给药部位，并观察对可能接触到受试物的周围组织的影响，例如考察血管刺激性试验应当对进针点血管的近段、中段及远段的刺激性，同时可附带肌肉刺激性考察；给药浓度、剂量与体积的设置应至少包括临床拟用最高浓度，临床静脉滴注给药刺激性试验可采用泵给药；给药频率与周期应根据临床用药情况，一般刺激性试验的给药周期最长不超过4周，其中血管刺激性试验最长不超过7 d；当出现阳性结果时，应当对造成阳性结果的可能原因进行分析。
制剂刺激性研究中常见的问题包括：未按照临床拟用给药方式、给药频率设计试验；临床用法中存在多种给药方式，未针对所有可能的给药方式开展研究。制剂安全性评价中，部分临床拟用给药方式在动物中无法模拟或操作困难，如脊髓鞘内、口腔黏膜、脑内给药等，可以考虑替代性研究方式。对于给药期末及恢复期的刺激性评估，需进行组织病理学检查，检查结果尽可能转化为可量化指标，如病变分级等，通常采用病变程度和发生率进行评估。比较特殊的眼用制剂刺激性研究应遵照相关指导原则的要求开展裂隙灯检查。
【案例5】 某一致性评价品种硫酸阿米卡星注射液，仅用参比制剂国外说明书临床用法用量情况[在静脉滴注的情况下，通常以100~200 mg（效价）的速度溶解在补液100~500 mL中，并在30~60 min内给药]拟定刺激性试验给药浓度为2 mg·mL-1，而参比制剂国内现行说明书（肌内注射或静脉滴注给药：当静脉内给予时可以按每500 mg加入无菌稀释剂100或200 mL来配制，如0.9%NaCl或5%的葡萄糖注射液或其他合适的溶液）中临床拟用最高浓度为5 mg·mL-1，不符合指导原则的要求。
吸入方式给药的制剂，包括粉雾剂、喷雾剂等剂型，应根据制剂自身的特点，尽可能模拟临床给药方式。试验中应采用符合试验动物自身特点的吸入装置或雾化装置，并进行充分的试验条件系统性验证（如气溶胶质量浓度、气溶胶粒径分布等），以获取稳定的气溶胶或粉雾气流，一般通过改变通气时间的方法完成不同剂量组给药，组织病理学检查应根据制剂药效及药代动力学特征，选取呼吸道不同部位组织器官进行病理学检查。
【案例6】 某噻托溴铵吸入粉雾剂，采用了经口喷雾给药的方式开展了制剂安全性试验，用兔经口腔喷雾给药方式，每天1次，连续给药28 d，未见对呼吸道给药局部组织的刺激作用，审评认为申请人所提供的局部安全性试验都不是吸入给药，试验结果不能体现临床拟给药方式的制剂安全性特征，需补充吸入给药途径的制剂安全性试验资料。
【案例7】 某富马酸福莫特罗吸入气雾剂（混悬型），与已上市富马酸福莫特罗吸入制剂（溶液型）相比，规格相当，给药途径相同且作用机制一致，按化药注册分类“2.2”申请临床试验，制剂安全性试验用大鼠全身暴露给药装置，经雾化吸入给药。申请人在分析该品种刺激性试验中，结合供试品在呼吸道局部及肺组织的暴露情况，并采用机构历史研究数据分析雾化吸入给药与直接揿压阀门吸入2种给药途径在呼吸道局部及肺组织的暴露差异较小，基本支持该品种桥接已上市制剂的药理毒理数据。
3.3.3 过敏性试验问题
过敏性又称超敏反应，系机体受同一抗原再刺激后产生的一种表现为组织损伤或生理功能紊乱的特异性免疫反应。通常局部给药发挥全身作用的药物（如注射剂和透皮吸收剂等）需考察Ⅰ型过敏反应，如注射剂需进行主动全身过敏试验（ASA）和被动皮肤过敏试验（PCA），透皮吸收剂需进行主动皮肤过敏试验（ACA），吸入途径药物用豚鼠吸入诱导和刺激试验，黏膜给药应结合受试物的特点参照经皮给药过敏性试验方法进行。因此，选择开展何种过敏性试验应根据药物特点、临床适应证、给药方式、过敏反应发生机制、影响因素等确定。
结合最常开展的主动全身过敏反应，试验结果与给予的致敏剂剂量，特别是激发剂量有较大关系，也与致敏的时间有一定关系，而与制剂的致敏浓度相关性略低。
值得关注的是，过敏性试验研究中常出现由于供试品毒性或特殊药理作用较强而导致动物死亡或其他严重异常表现，容易与过敏反应混淆发生，无法清晰地识别过敏反应风险。针对此类特殊情况，制剂过敏性试验的评价应当采用更为灵活的试验设计。
【案例8】 某注射用头孢替安仿制品，由于豚鼠对头孢类药物较为敏感，易产生消化道出血、坏死等毒性，在致敏期间动物即因消化道毒性全部死亡，可考虑结合大鼠被动皮肤过敏试验进一步评估过敏性。此外，针对常见的细胞毒类抗肿瘤药物，也存在过敏试验中动物死亡的问题，此类动物死亡一般也可归因于动物对制剂毒性的不耐受，可能与过敏反应相关性不大，但该类试验应采用设置参比制剂平行对照试验的方法开展研究，同时申报资料中应当包括预试验研究信息，以支持剂量选择的合理性。
另外，虽然动物试验中的吸入给药装置难以完全模拟人体吸入给药的暴露情况，但吸入制剂作为变应原可能会激发机体呼吸道黏膜免疫，进而由免疫球蛋白E（IgE）介导的Ⅰ型超敏反应发生，易引起安全性风险，因此吸入制剂采用吸入给药途径进行过敏性评估仍然具有必要性。
3.3.4 溶血性试验问题
溶血性是指药物制剂引起的溶血和红细胞凝聚等反应，凡是注射剂和可能引起免疫性溶血或非免疫性溶血反应的其他局部用药制剂均应进行溶血性试验。溶血试验包括体外试验和体内试验，常规采用体外试管法评价药物的溶血性，采用人血或兔血红细胞悬液试验体系，供试品应达到临床拟用最高浓度，仿制药一般应采用参比制剂对照开展研究，对于试验阳性结果，应当结合动物体内毒理学研究观察溶血反应的有关指标（如网织红细胞、红细胞数、胆红素、尿蛋白，肾、脾、肝继发性改变等），如出现体内溶血时，应对制剂的溶血风险开展进一步研究，与相同给药途径的上市制剂进行比较研究，必要时进行动物体内试验或结合重复给药毒性试验，应对相关机制进行探究，并推断与人体的相关性，以提示临床风险。
3.3.5 制剂安全性研究结果分析与评价
制剂安全性研究结果分析中，应详细说明不同组别用药情况、毒性反应、持续时间、恢复情况及时间、死亡动物数等关键信息，对不同剂量（或浓度）下某种反应发生情况及严重程度进行表述，分析毒性反应的量效关系和可能的时效关系及可逆性，判断药物相关性，提供安全范围等。刺激性试验应重视给药浓度、速度及次数等因素与结果的相关性分析，关注组织病理学检查并提供相应的图片结果；过敏性试验应注意给药剂量和给药速度对过敏反应的影响；溶血性试验中，若出现红细胞凝聚现象，应判定是真凝聚还是假凝聚，若体外出现可疑溶血现象，应采用其他方法进一步评估，以确定或排除受试物的溶血作用。此外，制剂安全性试验结果往往存在多种不确定性，由于试验设计的问题（缺少参比对照）、试验动物质量（阴性对照组异常结果）等问题，导致对试验结果无法做出准确的判断。
【案例9】 某吸入用盐酸氨溴索溶液按化学药品注册分类“3”申报验证性临床试验，用兔开展了制剂安全性试验，结果显示：兔多次雾化吸入局部刺激性试验中，阴性对照组动物可见鼻甲、咽喉、气管和肺及支气管黏膜出现黏膜上皮变性、坏死、增生，以及黏膜炎细胞浸润等炎症反应，出现的病理改变程度和比例明显高于同类试验，提示现有的试验体系可能无法判断动物产生呼吸道症状是否与供试品刺激性相关，审评认为该试验体系尚不能满足对吸入给药局部刺激性的评价。审评建议申请人结合已有非临床试验结果、安评机构背景数据、试验质量控制等因素，分析吸入给药局部刺激性试验结果中阴性对照组出现的病理改变程度和比例明显偏高的原因，选择合适的试验体系重新开展该品种吸入给药途径的刺激性试验。
【案例10】 某酒石酸阿福特罗雾化吸入用溶液按化药注册分类“3”申请验证性临床试验，该品种设计开展的刺激性试验仅设置阴性对照组和供试品组，供试品吸入途径给药可见轻度呼吸道黏膜刺激性，表现为肺血管周围轻微混合炎性细胞浸润、肺泡轻微巨噬细胞聚集，鼻轻度急性炎症，鉴于该品种吸入给药出现呼吸道刺激性情况，而未设置恢复观察期，也未设置参比制剂对照组，故无法判断本品刺激性反应的可逆性，也无法判断刺激性反应严重程度是否高于参比对照，应当重新开展规范设计的、与参比制剂对照进行的刺激性试验。
【案例11】 某德谷胰岛素利拉鲁肽注射液按生物类似物申报，溶媒对照组、自研品及原研对照组均可见高发生率的动物临床观察异常表现（发抖、排粪、排尿现象），发生率分别为100.0%或91.7%，申请人判断为“类过敏反应”，而非过敏反应。为佐证判断，试验人员在激发给药阶段，同时选择健康未致敏动物（每组4只）进行激发试验，显示出相似的异常表现为“发抖、排粪、排尿等现象”，符合相关指导原则关于“类致敏反应”的判断。
4 、其他需要开展制剂安全性情形
除了上述讨论的仿制药申请（包括一致性评价产品）需要关注制剂安全性评价外，创新药（包括改良新药）、生物制品变更等也需要特别关注制剂安全性的评估。
4.1 创新药
创新药的临床试验申请，一般需要提交全面的安全性评估资料。在制剂安全性研究方面，可以单独开展，也可以结合重复给药毒性试验数据开展，但伴随毒理学开展的制剂安全性评价应当涵盖制剂临床最高拟用浓度，如无法达到制剂相关浓度要求，应当开展单独的制剂安全性评估。
【案例12】 某降糖药按化药注册分类“1”申请临床试验，同时在临床试验期间新增制剂规格，原获批临床规格为1.5 mL/3 mg（质量浓度2 mg·mL-1），现申请新增规格为3 mL/30 mg（质量浓度10 mg·mL-1），仅新增一项单次给药的刺激性试验，而已完成的多项重复给药毒性试验所用药物浓度均远低于本次新增规格的浓度，无法评估新规格制剂多次给药后的刺激性特征，临床试验期间存在未知的安全性风险。
【案例13】 某人源化免疫球蛋白G（IgG）1亚型双特异性抗体，系一种注射用粉针剂型，在食蟹猴重复给药毒性试验中，伴随观察该双抗静脉给药的局部刺激性，结果显示，在不同剂量组，供试品溶液最高给药质量浓度仅为3 mg·mL-1，未见输注给药相关的刺激性反应。同时，由于本品临床用法用量未确定，而临床试验给药方案显示，临床试验期间最大给药质量浓度可能达到5.4 mg·mL-1，可能存在现有制剂安全性试验未提示的局部刺激性风险，应在临床试验前采用临床最大拟用浓度重新进行局部刺激性试验，并根据试验结果完善临床试验风险控制计划，确保受试者安全。
4.2 改剂型产品
除了前述提及的2款口颊膜、口溶膜制剂等改良型新药存在的问题，还有其他改剂型相关产品存在制剂安全性评价不足的问题。
【案例14】 某丁苯酞注射液按化药注册分类“2.2”申报临床试验，系由已上市的丁苯酞氯化钠注射剂（大输液，规格100 mL/25 mg）改成小容量注射剂（规格5 mL/25 mg），申请人未针对小容量制剂开展制剂安全性研究，仅提供了原报大输液制剂的研究资料作为参考，审评认为虽然大输液制剂与前期开发的丁苯酞氯化钠注射液的活性成分、适应证、给药途径、给药方法、单次给药剂量、主药辅料厂家以及生产工艺方面一致，但仍无法充分评估本次申报产品的制剂安全性特征，需要针对新报制剂开展制剂安全性研究。
4.3 生物制品变更
生物制品的制剂安全性评价思路与化学药品相似。而生物制品制剂的变更，尤其是涉及中等以上变更，往往是风险更高的一类情况，例如生产场地变更、生产规模变更、关键工艺控制及质量控制参数变更等，往往均需要制剂安全性评估。此外，由于生物制品制剂常含白蛋白成分，系常见的过敏原，可能会出现过敏性试验的阳性结果，应当结合制剂特点，综合分析并提示临床风险。
针对临床试验期间的变更，一般遵从国际人用药品注册技术协调会（ICH）Q5E指导原则的要求，结合生物制品在变更前后药学的可比性进行综合评价，“如果生产商能通过本文件推荐的分析研究方法来保证可比性，产品可比性的确定可以仅以质量研究为基础。当质量数据对确定可比性不充分时，恰当地是从非临床或临床研究中获得补充证据”。但基于中国的药品监管实践，生物制品的药学变更（尤其是重大变更）所带来的安全性风险远高于化学药品的安全性风险，药学比对研究往往无法作出“变更前后一致性”的结论，故需要非临床安全性对比研究进行的风险提示。
针对上市后生物制品制剂开展的变更，应当在药学方面可比的基础上，对于《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则（试行）》中，分类定为重大变更的，均需提供制剂安全性数据，中等或微小变更，应基于生物制品可比性研究结果综合分析处理。特别需要指出的是，如果变更后产品已在境外获得批准并用于人体，建议结合临床安全性信息评估，可不再要求开展非临床制剂安全性研究。
5、讨论
药物的非临床安全性评价是基于风险的识别研究，而制剂安全性研究是非临床安全性研究的重要组成部分。我国药品监管部门一直关注药物制剂安全性评价，其中非临床制剂安全性评价是重要一部分。美国食品药品监督管理局也于2023年4月发布了一份修订指南草案，关注了仿制药透皮和局部给药系统制剂刺激性和致敏性潜力的评估，以期为仿制药申请人临床制剂安全性评价提供科学和清晰的研究思路。
药物的制剂安全性研究，应当遵循药物安全性评价的一般规律，结合药物的制剂特点、药理作用其他毒理学试验结果，以及临床信息等综合分析和评价，以期全面真实地反映临床用药实际，为临床用药安全提供风险控制信息，确保临床用药安全。
