工艺开发过程的中加标实验，不是分析方法验证过程的加标回收实验，是考察反应耐受和杂质去除耐受常见的手段，是识别CMA，PAR，CPP的一种方式，也是起始原料和中间体质量标准制定的一个依据。

1. 什么是加标实验？ 

加标实验，又称为Spike实验，广义讲，向反应体系中故意加入某种物质，研究加入物质对反应的影响，考察工艺的耐受性。

狭义讲，向反应体系中加入某杂质，研究杂质的衍生和被清除情况，考察工艺的耐受性。

2. 为什么进行加标实验？

加标实验的根本目的是挑战工艺耐受性，提高工艺放大过程的操作重现和质量重现。

2.1 放大重现性因素

有些反应放大过程，不能完全重现小试的数据，常见案例如，放大过程杂质水平高于实验室研究，原料转化剩余高于实验室阶段研究，杂质被去除能力下降等，通过加标实验挑战工艺耐受能力，应对放大过程可能出现的各种质量异常，保证下一工艺可顺利按计划执行。

2.2 原料供应因素

有些原料或者试剂购买时，有限批次中杂质检出就是很小，放大购买时相同杂质检出水平可能很高，但是符合COA，此时至少要按照COA的标准进行加标实验研究，甚至更高。

2.3 起始原料发补的个例因素

起始原料的标准按照供应商的COA拟订，一旦发补要求起始原料前延，自己开发起始原料的合成工艺，发补的有限时间内能否开发出满足已拟定质量标准的合成工艺，风险很大，如果进行杂质加标挑战COA的限度，给自己的空间就会很大。例如供应商COA中杂质A拟定0.1%，可以进行杂质A水平0.5%的高限度挑战实验，根据实验结果放宽杂质A的限度。

2.4 工艺研究需要

工艺研究过程，可以通过实验中加入某些物质，调查某杂质来源、催化剂中毒原因、反应异常、设备匹配（加入不同材质的设备材料）等问题。

3. 什么时候进行加标实验？

目的不同，时机不同，基于工艺研究的需要，对杂质的理解，对参数的理解，对材质的理解，随时都可以进行加标实验。类似催化量水的加标，设备材料的加标等，一般在工艺优化中进行，边优化，边进行。

基于工艺的耐受性和质量标准制定依据，一定等工艺参数优化基本结束，分析方法基本确认，此时开展杂质加标实验才有意义，否则一旦工艺调整，原有的加标实验需要重新来过。

平行做完三批小试验证，根据检验数据，再开展加标实验，更有意义，依据加标数据制定质量标准。

4. 如何进行加标实验？

4.1 数据采集和分析

零点数据取样要有代表性，充分考虑杂质吸收和重量的关系。

要有杂质传递和去向的数据积累，例如包括分离前取样，分离后取样，以及母液样品的检验。

杂质去除能力评估，如果杂质A加标到1.0%，处理后衍生杂质B检出0.05%。根据杂质去除因子，理论评估如果杂质A 2.0%时，处理后衍生杂质B不会超过0.10%，这种评估有风险；反之风险低。

4.2 单步反应研究多个杂质，如何加标？

多个杂质同时加到一个反应中进行，分开独立加标是不合理的，因为原料或中间体的杂质谱是多个杂质共存的。必须考虑多个杂质之间的相互影响。有时候，独立的杂质在多个杂质存在下，不一定会定向衍生。

4.3 杂质加多少量合适？

这个没有标准，杂质限度越高工艺耐受性越好。

4.4 加标实验过程，反应没有正常转化，杂质加标有效吗？

加标无效，如果没有操作误差，加标后，反应没有正常转化，说明加标物对反应有影响，没有评估好杂质对工艺的影响，需要重新加标进行评估。